超声波辅助提取铜锤玉带草茎叶黄酮类化合物的工艺研究

刘伦沛　刘立波　邵显会　廖芳

摘要[目的]研究超声波辅助提取铜锤玉带草茎叶黄酮类化合物的最优工艺。[方法]以浓度70%乙醇为溶剂，采用超声波作辅助提取设备，通过单因子试验确定影响黄酮类化合物提取的主要因素及其最佳水平范围，并通过L9（34）正交试验确定最优提取条件。[结果]影响铜锤玉带草茎叶黄酮类化合物提取的因素主次为：超声波功率>浸提温度>提取时间>料液比；最优工艺条件为：超声波功率350 W，浸提温度60 ℃，提取时间30 min，料液比1∶20（g/ml）；在该工艺条件下，铜锤玉带草茎叶黄酮类化合物的含量为38.437 mg/g。[结论]试验得出的最优工艺条件可为铜锤玉带草的开发利用提供依据。

关键词铜锤玉带草（Pratia begoniifolia Lindl.）；黄酮类化合物； 超声波； 提取工艺

中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）07-01933-03

基金项目凯里学院教授专项科研项目（JS201310）；贵州省重点支持学科——植物学建设项目（黔教高发〔2011〕275号）；凯里学院生物科学专业基础课教学团队建设项目（JXTD201003）。

作者简介刘伦沛（1967-），男，贵州岑巩人，教授，硕士，从事生物化学、植物生理学的教学及生物资源开发与利用研究。

收稿日期20140210铜锤玉带草（Pratia begoniifolia Lindl.）为桔梗科铜锤玉带草属（Pratia）多年生平卧草本植物，又名小铜锤、地钮子、地石榴，主要分布于西南、华南、湖南、湖北、江西、浙江、福建、台湾、越南和印度等地，大多野生于海拔300～2 300 m的丘陵、阴湿田坎、低山草坡或疏林中[1]。

铜锤玉带草是我国民间一种重要中草药，以全草入药，具有利水消肿和解毒的功效，临床用于治疗急性肾炎、尿路感染和疗疮肿毒等。其果实味苦涩，性微温，能补肾强精，用于遗精、白带及小儿疳积等辅助治疗。云南民间用全草治疗风湿疼痛、跌打损伤、乳痈和无名肿痛等[2-3]，佤族将其用于治疗口腔溃烂症[4-5]。经生药学鉴定和化学成分分析，铜锤玉带草含有黄酮类、酚类、甾醇、氨基酸和高级脂肪酸酯等成分[6]，具有较高营养价值和保健价值。因其风味独特，是一种颇受人们青睐的野菜，现已逐渐成为宾馆、酒店的时尚菜。近年来，人们对铜锤玉带草进行组织培养和人工种植，取得较好的经济效益[7-9]。另外，该植物对土壤适应性比较强，具有耐旱、耐寒和抗病等特点，也成为一种园林地被植物。试验以铜锤玉带草全草为材料，研究其黄酮类化合物的提取工艺，以期为进一步开发利用铜锤玉带草提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。铜锤玉带草，于2013年8月15月采于贵州省丹寨县韭菜沟老冬寨林场溪沟边，标本贮存于凯里学院环境与生命科学学院植物生理学实验室。

1.1.2主要仪器。RE52 A 型旋转蒸发器，购自上海亚荣生化仪器厂；SHBⅢ 型循环水式真空泵，购自河南省巩义市英峪予华仪器厂；JYCCQ 超声波萃取仪，购自上海矩源机械设备有限公司；DS250 A型超声波清洗器，购自宁波市海曙达盛超声波仪器厂；电热恒温真空干燥箱，购自上海博迅实业有限公司；TU1800 型紫外-可见分光光度计，购自北京普析通用仪器有限责任公司；电子分析天平，购自上海精密科学仪器有限公司。

1.1.3主要试剂。芦丁标样，购自中国药品生物制品检定所；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、石油醚（沸程30～60 ℃）、无水乙醇等试剂均为分析纯，市售。

1.2方法

1.2.1样品的初处理。将采于贵州省丹寨县铜锤玉带草洗净，凉干，置于70 ℃电热恒温真空干燥箱中烘干，捣碎并过40目筛，存放于干燥器中备用。

1.2.2提取工艺流程。铜锤玉带草供试样品→浓度70%乙醇浸泡12 h →超声波辅助水浴加热浸提→ 抽滤→滤液浓缩→定容50 ml→取5.00 ml作5倍稀释（待测液）。

1.2.3线性关系的考察。采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定[10-14]。即准确称取经 120 ℃干燥至恒重的无水芦丁0.025 0 g，用浓度70%的乙醇溶解并定容至 100 ml，摇匀得芦丁标准品母液。分别吸取芦丁标准品母液 0、0.50、1.00、1.50、2.00和2.50 ml于10 ml干净的比色管中，加入0.30 ml浓度5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，静置 6 min；然后加入0.30 ml浓度10%的硝酸铝溶液，摇匀，静置 6 min；再加入4.00 ml浓度4%的氢氧化钠溶液，摇匀；最后用浓度70%乙醇溶液稀释到刻度，摇匀后静置15 min，用紫外-可见分光光度计测定510 nm处的吸光值（注：芦丁标准品溶液与铜锤玉带草样品总黄酮提取液经亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色反应后的扫描光谱得知，两者在可见光区的最大吸收波长均为510 nm），计算线性回归方程。

1.2.4黄酮类化合物含量测定。吸取样品提取待测液 1.00 ml，于10 ml干净的比色管中，同“线性关系的考察”操作步骤，用紫外-可见分光光度计测定 510 nm处的吸光值，通过回归方程计算样品黄酮类化合物的含量。2个重复，取平均值。

1.2.5铜锤玉带草黄酮类化合物提取单因素试验。称取一定量的铜锤玉带草供试样品，按照提取工艺流程，选择超声波功率、乙醇浓度、提取时间、料液比和浸提温度等因素作单因子试验，提取液经50 ml容量瓶定容，再作5倍稀释，经亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色，测定其510 nm处的吸光值，计算黄酮类化合物含量，以此为指标，考察各因素对铜锤玉带草茎叶黄酮类化合物提取的影响。（1）超声波功率对黄酮类化合物提取的影响。分别称取供试样品2.000 g，加入60 ml浓度70%乙醇，按照提取工艺流程，分别用200、250、300、350、400、450、500、550和600 W的超声波在50 ℃水浴中辅助提取30 min，经过滤、定容、稀释和测定其吸光值，计算样品中黄酮类化合物的含量。（2）乙醇浓度对黄酮类化合物提取的影响。分别称取供试样品2.000 g，按照提取工艺流程，分别用不同浓度的乙醇60 ml，在50 ℃水浴中用350 W的超声波辅助提取30 min，经过滤、定容、稀释和测定其吸光值，计算样品中黄酮类化合物的含量。（3）提取时间对黄酮类化合物提取的影响。分别称取供试样品2.000 g，加入60 ml浓度70%乙醇，按照提取工艺流程，在50 ℃水浴用350 W超声波分别辅助提取10、20、30 、40、50和60 min，经过滤、定容、稀释和测定其吸光值，计算其黄酮类化合物含量。（4）料液比对黄酮类化合物提取的影响。分别称取供试样品2.000 g，按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50（g/ml，W/V，下同）加入浓度70%乙醇，按照提取工艺流程，在50 ℃水浴用350 W超声波辅助提取30 min，经过滤、定容、稀释和测定其吸光值，计算样品中黄酮类化合物含量。（5）浸提温度对黄酮类化合物提取的影响。分别称取供试样品 2.000 g，加入60 ml浓度70%的乙醇，按照提取工艺流程，在不同的温度条件下用350 W超声波分别辅助浸提30 min，经过滤、定容、稀释和测定其吸光值，计算样品中黄酮类化合物的含量。

1.2.6铜锤玉带草黄酮类化合物提取正交试验。为进一步研究超声波辅助提取铜锤玉带草黄酮类化合物的优化条件，根据单因素试验结果，选择超声波功率、料液比、浸提温度和提取时间这4个因素，用L9（34）正交试验进行试验设计，提取其黄酮类化合物，测定其510 nm处的光吸光值和计算黄酮含量。以黄酮类化合物含量为考察指标，全面研究这4个因素的交叉作用对其黄酮类化合物提取的影响，各因素水平如表1所示。

2结果与分析

2.1线性关系的考察计算得线性回归方程为：Y=0.008 71X+0.003 62，相关系数R为0.999 93。试验结果表明，在0～0.062 5 mg/ml范围内，芦丁（黄酮）的质量浓度在所配制的梯度范围内，吸光度与黄酮质量浓度有很好的线性关系，即可按此法定量测定黄酮类化合物。