提取玫瑰基因组DNA几种方法的比较

王玉　贾锦山　张娜娜　赵兰勇

摘 要：为了找到一种方便、快捷且经济高效的玫瑰叶片基因组DNA提取方法，为玫瑰后期的分子生物学研究奠定良好基础，以不同品种的玫瑰幼嫩叶片为材料，分别利用CTAB法、SDS法、改良CTAB法、试剂盒法4种方法提取玫瑰基因组DNA，经过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法对所提DNA的质量和产量进行检测比较。结果表明：4种方法均可从玫瑰叶片中提取到DNA，改良CTAB法作为对常规方法的改进，在保证经济实用的前提下提取到的DNA质量最好，浓度最高；而试剂盒法作为一种快速提取植物基因组DNA的新兴方法，虽然产量略低，费用略高，但操作步骤简单，耗时短，毒害小，高效快捷。各实验室可根据实际情况选择适宜的方法。

关键词：玫瑰；DNA提取；CTAB法；SDS法；改良CTAB法；试剂盒法

中图分类号：S688.9 文献标志码：A 论文编号：2014-0054

0 引言

DNA作为生物遗传信息的载体，是重要的生物信息分子。提取高质量的DNA分子是对植物基因组进行分子生物学如分子标记辅助育种、图谱构建、基因定位与克隆、遗传转化和遗传多样性分析[1-2]等研究的重要基础。因此，能否快速且高质量的提取到植物基因组DNA将直接关系到整个试验的成败。目前，国内外对此方面的研究都已有不少。常用的DNA提取方法有十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法[3-5]、十二烷基硫酸钠（SDS）法[6-9]、高盐低pH法[10-12]、尿素法[13-15]、试剂盒提取DNA法[16-17]、热解法、氯苯法等。不同的植物材料要选择不同的提取方法，有的还要在传统的方法上加以改进。如赵志常等[3]利用改良的CTAB法提取番石榴的基因组DNA并对其进行SCoT-PCR扩增，浓度质量均符合试验要求；卢东柏等[9]利用改良后的SDS法提取棉花的基因组DNA，解决了棉花DNA提取质量不高且易褐变的问题；邵峰等[10]通过对CTAB法，SDS法和高盐低pH法3种方法的对比发现高盐低pH法最适合紫色辣椒基因组DNA的提取；而刘顺枝等[15]通过试验对比得出尿素法更适合超积累生态型和非超积累生态型的东南景天DNA的提取；梁玉琴等[16]则利用试剂盒法提取到了质量高、杂质少的柿属植物DNA，并简化了传统方法的操作步骤，缩短用时，降低毒害。

因目前尚无对玫瑰基因组DNA提取方法的比较研究，所以笔者以干燥的玫瑰幼嫩叶片为材料，采用4种DNA提取方法——CTAB法、SDS法、改良CTAB法、试剂盒法分别提取其基因组DNA，分析比较所提取到的基因组DNA质量与效率，以期找到一种方便、快捷且高效经济的玫瑰叶片基因组DNA提取方法，为玫瑰后期的分子生物学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

研究田间试验于2013年在山东农业大学林学试验站进行，室内试验在山东农业大学花卉研究所进行。

1.2 供试材料

1.2.1 材料来源 试验所用玫瑰材料共选取3个品种15株，3个品种分别为‘紫枝玫瑰、‘北京单白和‘唐白，全部取自山东农业大学玫瑰种质资源圃。采集新鲜、无病虫害的玫瑰幼嫩叶片，以塑封袋分装后加入硅胶颗粒吸收叶片水分，待叶片完全干燥后放于-20℃冰箱中保存备用。

1.2.2 试验药剂 CTAB提取缓冲液（1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCl，2%CTAB，pH 8.0）；SDS细胞提取液（500 mmol/L NaCl，50 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L β-巯基乙醇，1.5%SDS，pH 8.0）；改良2×CTAB提取缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2%CTAB，pH 8.0）；Tris-饱和酚；氯仿-异戊醇（V：V=24：1）；β-巯基乙醇；PVP；异丙醇；5 mol/L KAc；氯仿；70%乙醇；无水乙醇；RNaseA（5 mg/mL）；TE缓冲液；1×TAE溶液；6×loading buffer等。

1.3 4种方法提取玫瑰叶片基因组DNA

1.3.1 CTAB法提取DNA 具体操作过程和步骤参考韩玉杰等[18]的试验方法并进行改进。具体方法如下：（1）称取200 mg玫瑰干葉，在液氮中研磨成粉末状。（2）将粉末转移至1.5 mL离心管中，加入600 ?L预热的CTAB提取缓冲液，混匀后65℃水浴保温20 min。（3）取出离心管，加入等体积的氯仿-异戊醇，充分颠倒混匀。（4）12000 r/min离心10 min，转移上清液至新管中。（5）重复（3）、（4）步骤1次。（6）吸取上清液于新管中，加入0.6 V异丙醇，轻轻混匀。（7）14000 r/min离心10 min获得沉淀，70%乙醇洗涤后在室温下自然风干。（8）加入200 ?L TE缓冲液溶解DNA。（9）待DNA完全溶解后，RNaseA处理，并再次抽提。（10）获得上清液后加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。（11）70%乙醇洗涤沉淀，晾干后加入50 ?L TE缓冲液溶解，置于-20℃保存。

1.3.2 SDS法提取DNA 参见韩玉杰等[18]方法并进行改进。（1）取200 mg玫瑰干燥叶片，在液氮中研磨至粉末状。（2）将粉末转入1.5 mL离心管中，加入600 ?L 65℃预热的SDS细胞提取液，摇匀后置于65℃中水浴保温20 min，期间不时将离心管颠倒混匀。（3）取出离心管，冷却至室温，加入200 ?L 5 mol/L KAc溶液，混匀，冰浴20 min。（4）加入300 ?L氯仿，颠倒混匀，12000 r/min离心15 min。（5）将上清液转移至新管中并加入等体积4℃预冷的异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置30 min。（6）收集沉淀，用70%乙醇洗涤沉淀2次并晾干。（7）加入200 ?L TE缓冲液溶解DNA。（8）DNA完全溶解后，用RNaseA处理，并再次加入氯仿抽提。（9）得到上清液后加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。（10）70%乙醇洗涤沉淀，晾干后加入50 ?L TE缓冲液溶解，置于-20℃保存。

1.3.3 改良CTAB法提取DNA 参见徐宗大[19]的试验方法并进行改进。（1）取5～6片玫瑰干叶放于研钵中，加少许PVP，加入液氮迅速研磨成粉。（2）将约0.1 g粉末转移至2 mL离心管中，加入800 ?L 65℃预热的改良2×CTAB缓冲液和30 ?L β-巯基乙醇，充分混匀，65℃水浴40 min，期间每隔10 min颠倒混匀一次。（3）离心管取出冷却至室温，加入400 ?L Tris-饱和酚和400 ?L氯仿/异戊醇（24：1），颠倒混匀，12000 r/min离心15 min。（4）将上清液转入2 mL离心管中，加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇（24：1），混匀，12000 r/min离心10 min。（5）重复（4）操作。（6）上清液转入1.5 mL离心管中，加入2倍清液体积的4℃预冷无水乙醇，轻轻摇动离心管，管内即有白色棉团状DNA沉淀出现，-20℃放置30 min。（7）将沉淀挑入新管中，用70%乙醇洗涤2次。再用无水乙醇洗涤1次，于试验台静置至乙醇挥发干净。（8）加入50 ?L TE缓冲液溶解DNA。（9）待DNA完全溶解后，RNaseA处理样品，置于-20℃保存。

1.3.4 试剂盒法提取DNA 采用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒按说明书操作步骤提取玫瑰DNA。

1.4 DNA质量检测

1.4.1 琼脂糖凝胶电泳检测 琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA质量检测方法。取2 ?L DNA样品，与1 ?L ddH2O和2 ?L 6×Loading buffer混匀后点样于浓度为0.8%的琼脂糖凝胶中，在1×TAE电泳缓冲液，电压120V下电泳。约30 min后取出放于EB染液中染色20 min，在紫外光下观察电泳结果并拍照记录。

1.4.2 DNA纯度检测 用紫外分光光度法检测DNA样品的纯度与浓度。以ddH2O作为空白对照，测得玫瑰基因组DNA样品在波长260、280处的OD值，并根据OD260/OD280判断DNA的纯度。

2 结果与分析

2.1 4种方法提取的基因组DNA电泳检测结果与分析

4种方法提取不同品种玫瑰叶片基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1、2所示。结果表明，采用以上4种方法均可从干燥的玫瑰幼嫩叶片中提取到DNA，都可呈现一条亮带，无明显降解，且完整性较好。但SDS法和试剂盒法提取得到的DNA在点样孔中有少许残留物，说明这2种方法所提取的玫瑰DNA中掺有蛋白质等杂质。相比以上2种方法，CTAB法和改良CTAB法提取的DNA的点样孔较清晰可见，表明残留物少，基本上可排除DNA样品中的杂质污染。从图1、2对比来看，改良CTAB法提取到的DNA除‘紫枝玫瑰的2个样品有少许拖尾外，效果与CTAB法相近。但在实际操作过程中，CTAB法提取到的DNA因含有少量的酚类杂质，产生褐色沉淀且不易溶解于TE缓冲液，而改良CTAB法因为在提取过程中加入了PVP和β-巯基乙醇，减少了酚类及多糖类物质对DNA的污染，得到白色棉絮状DNA沉淀，提高了DNA的纯度。因此，改良CTAB法可作为一种高质量提取玫瑰叶片基因组DNA的方法。

2.2 4种方法提取的基因组DNA样品纯度分析

用紫外分光光度法测定DNA纯度时，纯净的DNA在260 nm及280 nm处的吸光度比值，即OD260/OD280=1.80。一般情况下，提取的基因组DNA的OD260/OD280在1.80～1.90之间时，说明为较纯净的DNA，质量较好[20]。4种方法提取到的玫瑰叶片总DNA的吸光度比值如表1所示。用SDS法提取的DNA样品的OD260/OD280比值在1.63～1.78之间，总体偏低于正常值1.80，表明该DNA样品中可能混有蛋白质或酚类物质。试剂盒法所提取的DNA OD260/OD280均大于1.90，结合琼脂糖凝胶电泳分析，照片中的DNA较为完整，排除DNA断裂的可能性，则可知该DNA样品中可能含有较多RNA，应用RNA酶重新处理样品。CTAB法和改良CTAB法相比于其他2种方法所提DNA的OD260/OD280比值较好，均在1.80～1.90之间，可见这2种方法对蛋白质、RNA等杂质去除的较为充分，DNA纯度较高，完整性较好。仔细对比两者还可发现，改良CTAB法提取的DNA纯度较CTAB法更稳定。从前3种方法所得DNA的浓度对比可知，SDS法提取的DNA浓度最低，说明该方法所获得的DNA量较少，而CTAB法和改良CTAB法所得的DNA量较多。综合来看，改良CTAB法所提取的DNA纯度与浓度较高，能很好的满足试验要求，可作为一种优选的提取方法。

3 讨论与结论

结合瓊脂糖凝胶电泳检测图和DNA的纯度表中数值综合分析可知，4种提取方法都可从玫瑰叶片中提取到基因组DNA。但比较来看，SDS法提取的DNA样品OD值在1.63～1.78之间，偏低于正常值1.80，说明其提取的DNA中蛋白质及酚类杂质较多且DNA浓度不高，所以不将其作为玫瑰叶片基因组DNA提取的首选方法；CTAB法和改良CTAB法提取DNA的效果相近，2种方法得到的DNA样品OD值均在1.80～1.90之间，2种方法对杂质的去除都较为充分，DNA纯度高，完整性好；改良CTAB法因其去除色素杂质的效果较好[20]且方法稳定，因此相比于常规CTAB法更适合玫瑰基因组DNA的提取；试剂盒法提取的DNA样品OD值都高于1.90，纯度稍低，表明样品中含有较多RNA，需RNAase的进一步纯化，但相比于传统方法操作步骤繁琐耗时，有机试剂危害人体等缺点，其提取到的DNA浓度高，制备方法简单、快捷、效率高。

本研究与以往类似的参考文献相比，相同点在于都是利用几种不同方法对某一植物材料基因组DNA进行提取，对比提取效果并选出最合适的提取方法；不同点在于由于试验材料的不同进而得到的最佳提取方法也不同，如卢东柏等[9]利用改良后的SDS法能提取到高质量的棉花基因组DNA；邵峰等[10]发现高盐低pH法更适合紫色辣椒基因组DNA的提取；本研究则认为改良CTAB法是更适合玫瑰基因组DNA提取的有机试验方法，而试剂盒法则可作为一种新兴的快速制备方法以供选用。玫瑰基因组DNA的提取除徐宗大[19]提出过的改良CTAB法外至今并无对该方面的比较研究，所以本研究以此为切入点开展试验并取得了一定进展与创新。研究发现传统有机提取方法以改良CTAB法为优，试剂盒法作为新型试验方法也可尝试采用。并且，在与其他相关文献的对比研究上还可得出结论：选用的方法虽然类似，但因选取的植物材料特性不同其最适宜的提取方法也不同，即使同为改良后的方法，因改良的侧重点不同，切不可生搬硬套，要因材制宜。

此外，改良CTAB法作为一种高质量且经济有效的提取玫瑰叶片基因组DNA的方法，应注意该方法在提取过程中的操作要点，以免因为操作原因影响DNA的提取质量。（1）取材。材料的选取对玫瑰DNA的提取质量有关键性的影响[20]。该试验采用的材料是玫瑰的幼嫩叶片，以幼叶红色褪去，叶片呈现鲜绿色时为最佳的取材时期，此时叶片中不仅DNA含量丰富且多糖、色素、酚类及蛋白质等次生代谢物质较少，便于去除，利于获得高质量的DNA。当不便采取新鲜叶片使用时，采样后应及时装入带有硅胶颗粒的塑封袋中使叶片迅速干燥，并于-20℃下保存，最大限度地减少DNA的降解。（2）磨样和水浴时间。材料研磨不充分或水浴时间不够都会影响DNA的产量[20]。因此，在用液氮研磨叶片材料时应多研磨几次。研磨所得的粉末越细越好，粉末颜色以灰绿色或白绿色为最佳。为了获得高质量的玫瑰DNA，在材料充分研磨的前提下，将水浴时间定为40 min，期间每隔10 min还要上下颠倒几次，使得改良2×CTAB缓冲液能充分裂解细胞。（3）防止褐化。玫瑰叶片中的多糖、多酚、色素及蛋白质等次生代谢物质易使DNA在提取过程中出现褐化，造成DNA的质量下降[21]。改良2×CTAB缓冲液中含有高浓度的盐，可有效沉淀多糖；提取过程中通过饱和酚、氯仿：异戊醇（24：1）的多次抽提，能有效去除蛋白质；β-巯基乙醇和PVP的加入，可防止酚氧化和酚类物质与DNA的结合[22]，最终通过乙醇的洗涤获得高质量的DNA。（4）避免剪切力。除了DNA的纯度对后续试验影响较大外，DNA的完整性对试验结果也有一定的影响[23]。DNA对剪切力非常敏感，为了得到片段较为完整的DNA，在提取过程中要尽量简化操作步骤，减少转移次数，并对离心速度和时间进行适当控制等；提取过程中应避免剧烈震荡，温和操作，用减去尖端的枪头吸取上清液，吸取过程中避免产生气泡。这样可以得到片段较大的DNA，保证后期的扩增结果。

改良CTAB法作为对常规CTAB法的改进，提取到的玫瑰基因组DNA浓度高且片段完整，杂质少，色泽透明纯净，质量好，是提取玫瑰基因组DNA优选的有机方法。但因其操作步骤的繁琐和耗时性，该方法更适用于样品材料不多，试验时间充裕的情况下。试剂盒法作为一种新兴的提取方法，能方便、快捷、高效地提取到符合操作要求的玫瑰基因组DNA，简化了传统方法的操作步骤且更加安全，但费用比传统方法略高。因此，在经费允许的情况下，试剂盒法可作为一种快速制备玫瑰基因组DNA的方法以供选用。各实验室可根据试验条件，经费支出，人员配备等具体情况，结合这2种方法的优缺点选择合适的提取方法。在以后的研究中还要对目前的方法予以不断改进，如进一步改良CTAB法，减少操作步骤，缩短操作时间；增强试剂盒法对复杂操作环境和植物材料的适应能力，保证稳定高效的提取效果，降低使用成本等。希望日后的研究能在现有的基础上探索出更完善、更适合玫瑰基因组DNA提取的方法。

参考文献

[1] 周春阳，谢立波，李景福，等.辣椒叶片基因组DNA提取方法的研究[J].辣椒杂志，2011（3）：35-37.

[2] 林强，邱长玉，朱芳荣，等.2种桑树基因组DNA提取方法的比较研究[J].广西蚕业，2011，48（2）：1-5.

[3] 赵志常，陈业渊，高爱平，等.改良CTAB法提取番石榴总DNA的初步研究[J].北方园艺，2013（09）：123-125.

[4] 高洪晓，杨凯，刘建斌.3种植物DNA提取法中多糖类物质去除效果的研究[J].北京农学院学报，2011，26（1）：70-72.

[5] Kur T C， Heien C C. RAPD analysis of Lycium barbarum medicine in Taiwan market[J].Bot Bull A，Acad Sin，2000，41（1）：11.

[6] 陆銮眉，朱旸，潘一山.几种常见方法提取番荔枝基因组DNA的比较[J].福建热作科技，2011，36（3）：10-12.

[7] 肖婷婷，朱艳，叶波平，等.鸢尾属药用植物总DNA提取方法的比较研究[J].中国野生植物资源，2010，29（3）：46-50.

[8] 王珍，方宣钧.植物DNA分离[J].分子植物育种，2003，1（2）：281-288.

[9] 卢东柏，李晓方，刘志霞.改良SDS法提取棉花基因组DNA研究[[J].广东农业科学，2008（5）：14-16.

[10] 邵峰，乙引，徐娟，等.紫色观赏辣椒基因组DNA提取及ISSR-PCR体系的优化[J].中国农学通报，2013，29（28）：101-104.

[11] 姚丹，闫伟，关淑艳.高盐低pH法提取大豆不同组织DNA的效果[J].河南农业科学，2009（12）：50-53.

[12] Miyake T， Yahara T. Isolation of polymorphic microsatellite loci in Hemerocallis fulva and Hemerocallis citrina（Hemero callidaceae）[J].Molecular Ecology Notes，2006（6）：909-911.

[13] 龙茜，刘洪章，刘树英.玉簪种质资源遗传多样性SSR分析[J].北方园艺，2013（17）：100-103.

[14] 徐虹，郑敏，章军，等.三种樟科植物的细胞总DNA提取[J].云南植物研究，2004，26（4）：451-457.

[15] 刘顺枝，刘雯，江月玲，等.东南景天DNA提取方法的比较[J].广州大学学报：自然科学版，2012，11（1）：27-31.

[16] 梁玉琴，李芳东，傅建敏，等.柿属植物基因组DNA提取方法比较[J].中南林业科技大学学报，2012，32（4）：170-173.

[17] 黄凤兰，郭志强，孟凡娟，等.试剂盒法提取蓖麻基因组DNA的条件优化[J].内蒙古民族大学学报：自然科学版，2010，25（1）：31-33.

[18] 韩玉杰，賈炜珑，王自霞，等.几种提取植物DNA方法的比较[J].山西农业科学，2008，36（7）：17-19.

[19] 徐宗大.玫瑰遗传多样性的SRAP分析与品种指纹图谱构建[D].泰安：山东农业大学，2011.

[20] 刘锴栋，袁长春，陈燕，等.不同方法提取野生荔枝基因组DNA效果的比较[J].北方园艺，2012（23）：105-109.

[21] 郭宝林，刘万水，黄文华，等.影响总DNA提取因素的探讨[J].中国中药杂志，2006，31（11）：924-926.

[22] 肖鲲，葛晓军，李小琼，等.改良CTAB法提取石斛总DNA[J].贵阳医学院学报，2007，32（2）：213-214.

[23] 李珊，王玛丽，赵桂仿.庙台槭总DNA提取及鉴定[J].西北植物学报，2001，21（2）：232-236.