玉米单倍体技术要点及其在育种中的应用展望

马海林　李继荣　卢保红　郭盛　张璐

摘 要：玉米单倍体技术可以大大缩短选育玉米自交系的代数，加速种质资源改良、创新与利用周期，为育种目标的快速实现提供可能。玉米单倍体育种技术是未来玉米育种中的核心技术，各个环节的优化是提高该技术效率的主要途径。本论文的主要目的是向育种研究人员系统介绍玉米单倍体技术的概念、发展过程、基本流程、环节优化及其在玉米育种中的应用情况，增进科技工作者对玉米单倍体育种技术的全面认识与了解，促进该技术在玉米育种中的高效利用。

关键词：玉米单倍体技术；诱导；优化

中图分类号：S513 文献标志码：A 论文编号：2014-0050

0 引言

玉米单倍体育种技术是近年来发展起来的一种快速获得玉米自交系的先进技术，该技术可以使玉米自交系纯化代数由原来的6～7代缩短为2～3代，大大加速了改良利用创新种质的时间，为育种目标的快速实现提供可能。利用该技术可快速获得自交系，缩短育种周期，加快育种进程。目前该技术在大型跨国玉米种业公司（杜邦先锋、孟山都、先正达、利马格兰、KWS等）的玉米育种环节中已大规模应用，成为选育玉米自交系的主要方法。玉米单倍体技术是一项系统化、规模化与工程化的技术，涉及很多技术环节，目前在国内该技术还处在研究发展当中，还有很多需要完善的地方，目前主要還是以规模换效率，以小课题组为单位的研究形式难以成功利用该技术，如何应变值得思考。随着玉米商业化竞争加剧与国家、地方政府政策支持重点的转移，中国的玉米育种研究者正面临前所未有的考验，玉米生产与玉米育种目标的改变对种质资源的创新利用研究提出了新的要求，创新效率急需提升，玉米单倍体育种技术正迎来前所未有的机遇。尽管目前国内玉米单倍体技术的研究报道较多，但多数只是集中在具体某一方面研究报道。当前国内玉米育种一线工作者对玉米单倍体技术的各个技术环节缺乏系统的了解与全面的认识，很有必要对这方面的知识进行普及，加强对该技术的宣传与推广，明确该技术体系中各环节的研究方向，增加对该技术体系的研究力度，提升中国种业在玉米商业化育种中的竞争能力与地位。

1 玉米单倍体相关技术研究概况

单倍体一般是指只具有配子染色体的细胞或个体，Bergner1921年在曼陀罗中发现了第1个单倍体植株，后人相继在烟草（Nicotiana tabacum），小麦（Triticum aestivum）等多种作物中发现了自发单倍体[1]。目前，全世界有250多个作物和物种应用了双单倍体育种[2]。据Randolph[3]的文章提到Stadler是玉米中最早描述单倍体的研究者。但直到1947年Chase[4]将选育的优良纯合的双单倍体系（DH系）用于商业化杂交种，玉米单倍体育种技术才有了实质性的发展。1951年Chase[5]报道了单倍体育种技术在玉米育种中的应用，并育成了世界上第1个有推广价值的DH系双杂交种DeKalb640，该杂交种是用3个DH系和1个骨干自交系育成的双杂交种，耐密性好，在美国东部、法国南部与意大利北部等地区得到了大面积推广。Chase还是第1个实现玉米单倍体自花授精的科学家[2]。自然界中玉米自发产生单倍体的频率极低，仅为0.05%[6]，远远不能满足商业化育种的需求。1941年Charles R.Burnham博士的研究生Coe从Northrup King种子公司得到1份具有红叶耳、白色胚乳和紫色糊粉层硬粒型独特遗传性状的晚熟墨西哥食用玉米品系作色素研究，1950年Coe[7]把它命名为Stock 6。经研究后发现Stock 6自交后会出现2.52%单倍体。随后他们又将一些色素标记（R1-nj等）导入Stock6中，Sarkar[8]将其运用到单倍体子粒的鉴定中，单倍体育种技术的相关研究也由此拉开了序幕。国外相继选育出WS14[9]、MHI[10]、RWS[11]和EMK[12]等一批优良孤雌生殖诱导系。国内这方面的工作起步较晚，但经过坚持不懈的研究，也取得了较大的进展，在诱导系选育方面先后选育出‘农大高诱一号[13]、‘吉高诱3号[14]、‘H01-H05[15]，‘农大高诱2-5号等[16]。目前玉米单倍体育种技术主要是利用植物孤雌生殖诱导系得到单倍体。经过孤雌生殖得到的自交系，纯度高，遗传稳定，配合力高，杂种优势强，在育种中有很大的实用价值和广阔的应用前景[17]。

单倍体的产生是单倍体技术中的核心环节，其中生物诱导是产生单倍体的最简易的方法之一。生物诱导产生活体单倍体途径有3种类型：品种间杂交可产生单倍体；不定配子体基因诱导可产生孤雄生殖单倍体；孤雌生殖诱导系杂交诱导产生孤雌生殖单倍体。目前成功利用的是孤雌生殖诱导系杂交产生单倍体的方法。用孤雌生殖诱导系花粉给其他玉米材料做杂交时，能够诱导相应的母本产生单倍体，产生的单倍体只包含母本的半套染色体组，很少含父本的染色体组。该方法由于操作简单，单倍体发生频率高，后发展为获得玉米单倍体的主要途径，成为玉米单倍体育种技术中的重要环节。狭义的玉米单倍体技术仅包含单倍体的获得与加倍过程，以得到纯合的玉米自交系为最终目标；广义的玉米单倍体技术应包含从组配材料到获得优良自交系过程中的各个环节及单倍体技术本身研究中的一些技术环节，以获得优良玉米组合为最终目标。

2 玉米单倍体技术的基本流程

玉米单倍体技术的基本流程包括4个重要环节：育种基础材料种质分析与组配、单倍体的诱导与鉴别、单倍体加倍、自交系筛选与测配。

种质分析与组配是根据育种目标对需要改良的种质资源与含有目标基因的种质进行分析与组配，根据遗传规律采用常规育种方法组配成基础的选系群体。选系群体可以是低代群体也可以是自交或回交两到三代的高代群体。

单倍体的诱导与鉴别：主要指单倍体的诱导与单倍体籽粒的挑选程序。利用孤雌生殖诱导系做父本诱导上述选系群体，进一步通过遗传标记或是其他方法鉴别出单倍体籽粒。选系群体的诱导规模要根据群体内材料遗传关系的远近来确定，血缘关系较近的用小规模，较远则需扩大诱导规模才有可能获得目标纯系；同时诱导系诱导率高低对诱导的规模影响也很大，要结合这两方面因素及预期获得目标自交系的数量做统筹安排。单倍体籽粒的挑选目前国内主要还是依据遗传标记的方法筛选出单倍体籽粒，另外也可结合单倍体的田间表现进行进一步的鉴别。

单倍体加倍可分为自然加倍与化学加倍。单倍体籽粒经过加倍后才能获得正常的二倍体纯合自交系。对于自然加倍率高的群体，采用直接种植单倍体籽粒，单倍体植株自发加倍后变成可育株，将散粉株自交就能获得自交系，但对于一些自然加倍率低的群体則必须采取化学加倍的方法才有可能获得尽可能多的目标纯系。

自交系筛选与测配：通过加倍后获得自交系要再加一代才能得到足够多的自交系种子，在加代过程中可根据自交系的植株及果穗性状淘汰掉大部分不符合育种目标的自交系，获得的纯系最好再经过1年多点或是多年多点的综合表现进行筛选才有可能获得优良的目标纯系；另外也可通过分子标记辅助选择技术对自交系进行目标基因筛选直接获得目标纯系。得到的目标纯系通过进一步的配合力测试得到优良组合。

3 玉米单倍体技术的优化

目前国内单倍体技术还处在发展当中，效率较低，许多技术环节还有待改善与提高。玉米单倍体技术优化的根本目标是提高获得优良自交系的效率。主要包括以下几方面内容的优化：单倍体诱导，单倍体鉴别，单倍体加倍，DH系管理。

3.1 单倍体诱导环节的优化

主要集中在以下几个方面：诱导系，母本材料，诱导地点，诱导时间。诱导系的诱导率、遗传标记、农艺性状是优化重点。主要是用遗传改良的方法提高诱导率，目前国内外较好的诱导系平均诱导率在10%左右；遗传标记是人工快速挑选单倍体籽粒的重要依据，所以加强诱导系中遗传标记的选择有利于快速准确地挑出单倍体籽粒。农艺性状改良主要是提高诱导系的散粉性与抗倒性，实践表明多数茎杆携带紫色标记基因的诱导系抗倒性较差，不易改良。另外多数诱导系本身雌雄不调，结实性差，目前这些性状用常规育种的方法改良效果还不是很理想，可能诱导率性状与这些性状有关联。母本材料的优化主要是根据母本材料的遗传特性制定诱导计划，以便获得足够多的单倍体。当母本材料群体内的遗传差异小时可用较小的群体规模，但群体内遗传差异较远时则要考虑放大诱导规模。诱导地点、时间的选择可以改善诱导系与母本材料的自然与栽培条件，减少病、虫、害、光照、水肥等因素对诱导系与母本材料正常生长的影响。另外单倍体诱导系一般生育期都较短，需要通过错期播种技术调节花期，同时为保证杂交的质量，母本材料均要严格套袋隔离，采用隔离区制种方式诱导时也要对隔离条件做严格要求。

3.2 单倍体鉴别程序的优化

单倍体鉴别主要是指从诱导后果穗籽粒中挑选出单倍体籽粒，目前主要还是依据玉米籽粒胚乳顶部糊粉层的紫色标记来鉴别。经单倍体诱导系诱导杂交后一般的二倍体籽粒表现胚乳顶部糊粉层与胚芽呈紫色，该性状由R1-nj基因所控制，在籽粒中表达较为稳定。该环节的优化主要是将鉴别过程分三步进行：第一步是粗筛选，就是将单倍体由工作人员从杂交籽粒中初步挑选出来，这一步建议在果穗上进行，因籽粒在果穗上胚面均向穗尖方向排列，通过比较鉴别很容易发现胚芽无色的单倍体籽粒，但如果遇到不好脱粒的果穗则需先用机器将籽粒脱下后再挑选以加快挑选效率。第二步是精细挑选，就是对挑出的单倍体籽粒由较专业的工作者再进行一次严格挑选，剔除掉那些可疑单倍体籽粒。第三步是单倍体的田间鉴别，一般来说颜色标记比较明显的单倍体籽粒经过前面两个步骤后假单倍体所占的比例基本能控制在5%以下，单倍体植株在田间一般表现比较弱小，二倍体植株与杂株表现强壮高大，据此特征可以在田间直接去除假单倍体。另外单倍体鉴别程序的优化还体现在依据籽粒的其他特征性状进行单倍体鉴别的研究，中国农业大学陈绍江课题组已研制出利用油份花粉直感效应鉴别玉米单倍体的自动化筛选机器。

3.3 单倍体加倍优化

单倍体加倍优化主要有以下几方面内容：第一是根据群体的特性选择合适的加倍方法。目前国内主要加倍方法是自然加倍法和以秋水仙素处理为主的化学加倍法。对于自然加倍率高的群体采用自然加倍的方法最为适宜，对于那些自然加倍率低的群体则需采用化学加倍，以提高获得纯系的效率。第二是选择合适地点种植单倍体并加强田间栽培管理。单倍体植株由于生长势较弱，对环境条件比较敏感，特别是散粉期间，最好选择光照充足，阴雨天气少、水肥条件较好的地点种植，土壤条件以沙性土壤为好。第三是授粉方式优化。多数发生自然加倍的单倍体植株可散粉的花药只有少数的几个，且雌雄不协调，多数雌穗授粉前需要剪去苞叶才能露出花丝。授粉前单倍体雌穗需要套袋隔离，单倍体雄穗不需套袋。于雄穗开花当天将花粉轻轻抖在干净的雌穗袋上，再小心均匀地转移到花丝上，对于较嫩的花丝剪苞叶时应尽量避免剪到花丝，一些花粉没有自然散出的饱满花药需用小剪刀剪掉花药尾部一小部分，将花粉抖出后进行授粉操作。授粉后当天下午或第二天如有时间要检查已授粉株是否还有花粉，如有则最好进行二次授粉，以提高结实率。每次授粉后要对双手及授粉器具用酒精进行消毒，避免花粉污染。进行化学加倍后的单倍体植株如果散粉量相对较大，雄穗有时也需要套袋隔离后取粉，以避免花粉污染。化学加倍方法国内目前以中国农业大学的芽苗法较为理想（私人通讯），加倍效率能达到30%以上。

3.4 DH系管理优化

经过单倍加倍后获得的自交系，又称为DH（Doubled haploid）系，由于加倍当代种子量很少，还需扩繁一代才能有足够的种子量进行下一步的研究，同时扩繁过程还可根据整齐度等田间农艺性状表现淘汰杂合的假自交系。由于加倍后得到的自交系仅经过自然选择与淘汰，自交系数量较大时还不适宜直接用于配合力测试。DH系管理优化主要是通过自交系的多点表现筛选符合育种目标的优良自交系，淘汰大部分不符合育种目标的自交系，应根据不同的育种目标制定相应的筛选策略，将来也有可能利用分子标记的手段来直接对DH系进行筛选直接获得符合育种目标的自交系。经过筛选后得到的优良自交系就可以进行下一步配合力的测定程序。

4 单倍体技术在玉米育种中的应用

4.1 在种质资源创新利用中的重要价值

长期以来中国玉米种质资源引进的多，能利用的少，主要原因是常规育种技术育种周期长，可预见性差，导致种质资源的利用远远落后于生产需求。玉米单倍体技术可以快速获得并筛选出符合育种目标的自交系，大大缩短了种质资源的利用周期，进而快速选育出符合生产需求的优良品种。随着玉米商业化育种的竞争加剧，玉米单倍体技术越来越显示出优越性，可以预见玉米单倍体技术是未来育、繁、推一体化大型种子公司获得玉米自交系，选育玉米新品种的主要技术手段。

4.2 自交系纯化

玉米自交系种子在使用过程中会由于各种自然或人工原因发生退化，使杂交种的整齐度与杂种优势减弱，商品性下降。所以对于一个优良品种而言，亲本自交系的提纯复壮是一个很重要的工作程序。利用玉米单倍体技术可以快速选育到与原亲本自交系接近的纯系。

4.3 快速稳定优良基因，淘汰不良性状

由于单倍体技术选育自交系的过程中种子经过一个由二倍体到单倍体再到二倍体世代的转换，在单倍体世代中种子的各种性状均可得以表现，多数不良基因控制的性状会导致单倍体种子和植株生活能力下降、高度不育，进而实现自然淘汰。同时由于单倍体技术只经过两代就可得到纯系，通过对纯系表型或基因的筛选鉴定就可得直接获得理想的目标自交系。

5 展望

目前玉米单倍技术研究主要集中在单倍体诱导机理研究[18-28]，诱导系选育[29-32]，单倍体鉴别[33-36]、加倍[37-39]，DH系的筛选与测配体系研究[40-42]等方面。玉米单倍体技术的效率正在逐步提升，但该技术涉及的技术环节较多，是一项系统化、工程化的综合技术，人力、物力投入均较大，并不适合规模小的课题组，更适合于规模较大有实力的育、繁、推一体化的种业公司使用，对中国的种业公司而言应加强单倍体技术的集成与优化创新等方面研究。玉米单倍体相关技术的研究促进了玉米单倍体技术在育种中的广泛应用，系统了解该技术流程的各个环节有利于育种科研人员对该技术进行集成创新应用。随着国内玉米种植模式与收获方式的转变，国内玉米育种的种质资源面临更新换代，创新与改良发展利用新的种质资源给单倍体技术带来新的机遇。玉米单倍体育种技术与其他玉米常规育种选系技术相比，在自交系纯化方面具有不可替代的优越性。但在群体组建与改良前期，其他的育种方法例如回交育种与群体轮回选择等方法还是必不可少的。所以今后的育种技术革新必然是常规育种技术与单倍体育种技术的有机结合。另外随着分子生物学技术的快速发展，分子标记辅助选择技术必将融入玉米單倍体技术体系，成为目标基因导入或性状改良中检测、跟踪靶基因的最有效工具。

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