发酵肉制品菌群的非培养鉴定技术研究进展

王稳航　徐倩倩　滕安国　刘安军

摘 要：随着分子生物学技术的快速发展，以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）为基础的非培养鉴定技术在发酵肉制品菌群鉴定中得到越来越广泛的应用。其方法主要有种特异性PCR、聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳等。与传统的分离培养鉴定方法相比，非培养方法具有直接、快速、准确、实时等优点，但同时也存在一些缺点，如样品复杂程度、DNA（RNA）提取条件、PCR反应过程的差异等均可影响鉴定结果。非培养鉴定技术与传统微生物鉴定技术相结合，能够对发酵肉制品菌群多态性和动态变化做出准确的鉴定。

关键词：发酵肉制品；菌群；非培养方法；种特异性聚合酶链反应；聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳

Culture Independent Methods for Investigating Microbial Ecology of Fermented Meat

WANG Wen-hang， XU Qian-qian， TENG An-guo， LIU An-jun

（College of Food Engineering and Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China）

Abstract： With the rapid development of molecular biological technology， culture independent methods based on polymerase chain reaction （PCR） technology have an increasing application in the identification of microorganisms in fermented meat. The existing culture independent methods mainly include species specific PCR and PCR-denatured gradient gel electrophoresis/temperature gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE/TGGE）. Compared with traditional culture dependent methods， culture independent methods have some advantages such as direct， rapid， accurate and real-time， but also have disadvantages because the results may be influenced by sample complexity， DNA extraction and PCR reaction. The combined application of culture dependent and culture independent methods may provide the best estimation of polymorphism and dynamic changes of microorganisms in fermented meat.

Key words： fermented meat； microorganisms； culture independent methods； species specific polymerase chain reaction （SS-PCR）； polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis/temperature gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE/TGGE）

中图分类号：Q93.331 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）09-0017-05

自1940年开展自然发酵肉制品菌群的分离鉴定和商业发酵剂的研发以来，发酵肉制品生产得到了快速发展。尤其是近几年来，欧美一些国家（如意大利、西班牙等）发酵肉制品在肉类制品市场上的份额达到15%以上，占有举足轻重的地位。

由于传统自然发酵方式存在生产周期长、产量低、食用安全性差等诸多缺点，加上发酵肉制品市场需求的不断增大，利用直接添加发酵剂工业化生产发酵肉制品已成为主流。欲制备工业发酵剂，首先要对自然发酵肉制品的菌群进行分离、鉴定，寻找对发酵肉制品品质具有重要贡献的微生物，然后通过人工培养生产工业发酵剂，再直接添加于鲜肉中生产发酵肉制品。另外，对发酵肉制品生产过程中微生物菌群变化进行动态检测也是调控肉制品质量的关键。因此微生物鉴定技术已成为发酵肉制品生产的重要内容。

根据是否需要对样品中微生物进行分离培养，微生物鉴定技术可分为培养方法和非培养方法。培养方法鉴定技术即为传统的微生物鉴定技术，是指将待检样品转接在培养基上，模拟待检微生物的生长条件，待生成单个菌落后，再对其进行生理生化、分子生物学等指标的检测，以确定微生物种类。最近十年的研究不断证明传统分离培养鉴定技术不能清楚描述发酵食品的微生物菌群的多样性，也不能对优势菌群进行准确计数[1]。其主要障碍就是待检菌种必须进行分离纯化后，才能进行生理生化，如革兰氏染色、乳酸脱氢酶、过氧化物酶、糖发酵种类、二氨基庚二酸、产乳酸特性、精氨酸水解能力等相关检测实验。然而理化检测有时现象不明显，甚至有时不同菌种之间相互混淆，比如来源于肉制品的弯曲乳杆菌（L. curvatus）和清酒乳杆菌（L. sakei）就不易区分。虽然聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、核酸探针等分子生物学技术可以部分解决这一问题，但分离培养的繁琐过程费时费力，一般需要1周以上才能完成，不能对发酵肉制品发酵过程的菌相变化进行有效的实时监控。

培养方法鉴定技术的另一缺陷是这种方法仅适用于一些容易培养的菌株，而对一些进行富集或选择性培养比较困难的菌株则无法进行鉴定[2]。据估计，自然界中能用于人工培养的微生物种类不超过1%，这也限制了传统培养鉴定技术的应用[3]。

非培养方法是指不需进行待检微生物的富集或分离，从样品中直接分离DNA或RNA，再以分子生物技术手段进行分析鉴定来反映微生物菌群多样性和动态的一类微生物鉴定技术[4]。这些技术主要采用PCR技术并辅以其他技术为基础，在鉴定过程中不需进行目标菌的分离纯化从而避免了人为因素影响，从而更能快速、准确、科学地反映发酵过程中菌群的多样性、复杂性和动态变化，尤其是可对不同微生物之间协同、拮抗作用以及对发酵肉制品品质的影响进行综合性研究[5]。

经过近年来的不断研究，已发展了多种以PCR反应为基础的发酵肉制品非培养鉴定技术，主要有种特异性PCR、PCR-变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）/温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）等。

1 种特异性PCR

1.1 种特异性PCR技术原理

PCR技术已经广泛用于微生物的鉴定和检测，其主要以16S rRNA和23S rRNA为扩增区域，通过分析其间差异鉴定微生物种类[6]。但在一些相近的种，如L.sakei和L.curvatus，由于它们的rRNA序列的高度相似性，不能利用此种方法进行鉴定，而16S～23S rRNA ITS区间（inter genic transcribed spacer）序列由于进化速度比16S rRNA快10倍以上，不同微生物种间具有较大的碱基差异，因此可用来区分亲缘关系较近的菌种。这种根据不同种类微生物基因特定区间差异设计特异性引物，进行PCR扩增进行微生物鉴定的方法称为种特异性PCR，其能够有效、快速、准确地进行发酵肉制品菌群的检测。

1.2 种特异性PCR技术应用

与传统PCR相比，种特异性PCR更方便、快捷、准确，交叉感染的机会大大降低，并且能够实现高通量、宽动态、自动化[7]。同时，近十年乳酸菌的基因序列的不断阐明，为种特异性PCR的引物设计也提供了很大帮助，推动了种特异性PCR的广泛应用。

Aymerich等[8]根据不同种类微生物设计了12对引物，利用种特异性PCR技术鉴定了西班牙Chorizo香肠和Fuet香肠的乳酸菌（LAB）和凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）菌群，并对未富集和富集的2种样品前处理方法进行比较。结果发现，不通过培养基富集，直接从发酵香肠样品中提取DNA，L.sakei和L.curvatus检出率为11.8%，植物乳杆菌（L. plantarum）和木糖葡萄球菌

（S. xylosus）检出率为17.6%。而通过富集后，L. casei和S. xylosus检出率为100%，屎肠球菌（E. faecium）检出率为11.8%。原因可能是样品中含有干扰物质，抑制了PCR反应，使结果呈阴性。

Marít等[9]利用螯合型离子交换树脂Chelex100对发酵香肠样品进行前处理，并设计SakF

（5-GATAAGCGTGAGGTCGATGGTT-3）和SakR

（5-GAGCTAATCCCCCATAATGAAACTAT-3）种特异性引物扩增16S-23S rRNA ITS区域，利用种特异性PCR技术对发酵香肠的L.casei进行了实时动态计数。通过螯合型离子交换树脂Chelex100处理样品而不进行DNA纯化，PCR扩增结果表明L.casei检出下限为3个菌/反应，相当于3×103 CFU/g样品，检测结果从6×105～32×105个菌/反应范围内呈线性关系（R2=0.996）。利用这种方法对11 个发酵香肠样品中L.casei数量进行检测，结果与MRS平皿计数比较，相对准确度在91.24%～98.16%之间，统计结果表明实时PCR计数与平皿计数结果无显著差异。上述前处理方法与DNA纯化方法相比，除样品所需菌浓较高外，分析并无其他PCR干扰现象发生，因此这种前处理可有效对发酵香肠菌群进行实时定量。

1.3 种特异性PCR技术优缺点

种特异性PCR的特点是快速、准确、灵敏度高、特异性强。利用种特异性PCR进行微生物鉴定，样品不需要分离纯化，可以在提取DNA（RNA）后直接扩增，利用种属差异性检测特定条带，达到检测鉴定目的，因而省时省力。另外，根据种属差异设计特定引物，检测结果灵敏度、准确度都较高[10]。

但是，种特异性PCR也存在一些缺陷。首先，种特异性PCR和其他PCR一样，是以现有基因序列为模板进行扩增，因此仅适用于已测得基因序列或清楚相关遗传信息的微生物的检测鉴定。同时，由于食品成分复杂，尤其是一些PCR抑制剂的存在，如蛋白酶、血红素化合物、螯合剂和蛋白质等，均可降低检测灵敏度。因此，利用种特异性PCR进行菌种鉴定必须进行样品预处理，如样品稀释、离心、过滤、双水相萃取、吸附、DNA纯化等方法来消除发酵香肠中PCR抑制物。另外，采取扩增内标方法可有效避免不同原因造成种特异性PCR反应的假阴性现象[11]。反应体系中加入扩增内标后，扩增内标可与模板DNA同时扩增，若在反应体系中目标序列的浓度较低或不存在时，应该有扩增内标的扩增产物出现，如果PCR反应中没有产生任何扩增产物，说明反应受到抑制，产生了假阴性，需要重新提取DNA进行PCR反应。

2 PCR-DGGE/TGGE

2.1 PCR-DGGE/TGGE技术原理

PCR-DGGE/TGGE技术最早由Fisher等[12]和Lerman等[13]于1979年提出，是指不同生物DNA特定序列的相同长度PCR扩增产物在各自相应变性剂浓度（变性温度）下发生空间构型变化，导致产生不同的电泳速度，最后在不同相应位置停止，并经过染色分辨DNA片段差异的电泳技术。

不同微生物的16S rDNA片段长度相同，但序列变化多样，在经过适当变性后，可停留在DGGE谱图上的不同位置，进而根据DGGE电泳条带、相关序列以及16S rDNA基因组资料，从而可以区分和鉴定不同种类微生物。理论上讲，对每一种微生物16S rDNA的可变区域进行扩增都会产生一个不同的DGGE图谱[14-15]，因而可同时检测多个样品并可比较不同时间和不同环境的微生物菌群变化情况。

2.2 PCR-DGGE/TGGE技术应用

随着1993年Muxzyer等[16]首次将DGGE技术应用于微生物生态学研究，PCR-DGGE技术在环境生态、海洋生态、肠道菌群等领域[17-19]的研究中不断得到应用。最近几年来，PCR-DGGE技术开始被逐渐应用于发酵食品微生物研究，如用于监测中国镇江香醋[20]、意大利发酵玉米团[21]、韩国发酵豆酱[22]和日本大米黑醋[23]等的菌群变化。

Cocolin等[24]利用PCR-DGGE技术对发酵香肠的菌群组成及动态变化做了系列研究。首先，对意大利发酵香肠菌群动态变化过程进行监控。通过直接从发酵香肠中提取DNA，设计5对不同引物对16S rRNA的V3、V9、V2-V3、V6-V8、V1、V3等不同区域进行扩增，结果发现只有P1（5-GCGGCGTGCCTAATACATGC）、P2（TTCCCCACGCGTTACTCACC-3）引物扩增的V1区PCR产物才能对Lactobacillus spp.、Staphylococcus spp.、 Kocuria spp.等不同菌种进行有效鉴别，不同种间没出现共迁移现象。对DGGE浓度的选择上，发现40%～60%的变性梯度能进行Micrococcaceae和Staphylococcus之间的区分；而30%～50%的变性梯度能进行所有Lactobacillus属的菌种区分。在发酵过程第1天的DGGE谱图上出现多个条带，经过序列分析，大部分为Staphylococcu spp.，从发酵第10天开始，仅有LAB条带出现，而其中以L.sake和L.curvatus为主，表明香肠发酵过程以LAB为优势菌种，Micrococcaceae属仅占次要位置。在发酵香肠中，PCR-DGGE技术的检测下限为104 CFU/g样品。

接着，Cocolin等[25]利用DGGE技术研究了新鲜发酵香肠中菌群动态结构。结果发现香肠成熟第1天，仅有L. curvatus出现，随后在第3天消失；B. thermosphacta在第2天出现，并贯穿整个成熟过程；S. xylosus仅在第3天出现；第6天检出了L. casei，并且其在以后成熟期保持数量稳定；第10天时检出了肠膜明串珠菌

（L. mesenteroides）。而以RNA为模板扩增所得DGGE条带比以DNA为模板扩增所得DGGE条带丰富得多，除以上细菌外，还出现了多种未知菌。同时，以NL1

（5-GCC ATA TCA ATA AGC GGA GGA AAAG-3）和LS2（5-ATT CCC AAA CAA CTC GAC TC-3）为引物进行PCR扩增，发现了Debaryomyces hansenii和Capronia mansonni等酵母的存在。

Fontanaa等[26]利用Bact-0124f（GC）（5-CACGGATCCGGACGGGTGAGTAACACG-3）-Uni-0515r（5-ATCGTATTACCGCGGCTGCTGCTGGCA-3）引物扩增16S rDNA上V2-V3区域序列，以V3f（GC）（5-CCTACGGGAGGCAGCAG）-Univ-0515r（5-ATCGTATTACCGCGGCTGCTGCTGGCA-3）引物扩增V3区域序列对阿根廷发酵香肠中菌群进行了分析。结果发现，以40%～60%的变性凝胶梯度浓度进行分析结果较好。扩增的V3区在发酵开始时，DGGE谱图上出现了较多条带，1～6条带依次被鉴定为L. plantarum、乳酸片球菌（P.acidilactici）、L.casei、L. curvatus、马胃葡萄球菌（S.equorum）和腐生葡萄球菌（S.saprophyticus），条带10被鉴定为C.variabilis。微生物检出下限为104 CFU/g

样品。

Cocolin等[27]对商用发酵剂直接发酵香肠过程中的菌群进行检测。利用DNA为模板对16S rDNA区间序列进行扩增，仅发现L. plantarum和肉葡萄球菌（S.carnosus）存在，而以RNA为模板扩增还发现S.xylosus存在。

2.3 PCR-DGGE/TGGE技术优缺点

PCR-DGGE/TGGE作为一种新兴的微生物鉴定技术，具有耗时少，仅需8 h即可完成，结果重现性好，不需分离单个菌落等诸多优点[28-29]，因而能够同时鉴定大量发酵肉制品样品微生物组成，并可用于监测发酵过程中微生物群落的动态变化过程，尤其对于一些培养困难或根本不能培养的菌株的鉴定具有很大的应用潜力。

但是，PCR-DGGE/TGGE本身也存在着一些技术缺陷。首先，DGGE/TGGE由于其高分辨率，所分析的DNA片段较小，一般在500个碱基对以下，因此得到的微生物系统信息较少，其次，DGGE/TGGE图谱中一般只能分辨1～20个条带，这些条带大多仅反映微生物群落中的优势菌群，可能只有占总微生物数量1%以上的种群才能被检测出来，而弱势菌群根本不能被检测到。

另外，样品菌群的复杂性、核糖体RNA拷贝数、提取纯化DNA、PCR扩增等方面的差异，也会对鉴定结果产生影响。理论上，同种微生物的DGGE谱图应该仅有单一条带，但实际上可能会出现多个条带[30]。造成这一现象除与实验条件有关外，rRNA的多态性也是主要原因之一。同一微生物核糖体基因可能存在多个拷贝，由于这些拷贝呈微观不均一性，而DGGE技术的高分辨率，导致其16S rRNA扩增呈现多个条带，因此夸大了微生物菌态的多样性[31]。Rantsiou等[32]提出了解决这一问题的方案。编码RNA聚合酶的β亚基的rpoB基因通常仅有一个拷贝，扩增后产物也仅为一条谱带。其根据rpoB基因设计引物扩增，PCR产物的DGGE图谱能够清楚分辨出Lactobacillus、Lactococcus、Enterococcus、Streptococcus、Leuconostoc和Weisella，因此可用这一基因进行复杂发酵样品（如发酵香肠、奶酪等）微生物菌群的检测。

3 结 语

非培养鉴定技术具有实时、科学、方便等优点，对发酵肉制品的菌群结构及动态分析具有很大的潜在应用价值，但作为一种新兴的鉴定手段，尚未形成统一的方法和程序[33]。一般来说，发酵肉制品的非培养鉴定技术的应用存在3个关键点：第一，样品DNA提取。DNA提取是非培养方法研究中的第一步，也是关键的一步，如何高效提取样品中菌群的DNA显得至关重要。DNA提取中混杂杂质如蛋白质等会干扰PCR反应，另外样品中菌群含量过低，或DNA提取过程中损失较大，均可影响最终PCR反应。DNA提取目前没有统一标准步骤，一般均通过实验根据不同样品确定最佳提取条件。第二，特异性引物设计。根据不同微生物种类的DNA/RNA特定区间序列的变化，设计适宜的引物，对检测结果将起到至关重要的作用。第三，PCR反应和DGGE/TGGE反应条件的选择。理论上，DGGE谱图上每一条带均代表1个不同的物种，但是，由于PCR反应过程中嵌合体、共迁移、异源双链体的存在可能会使实验结果产生偏差，因此必须根据不同目的确定适当的反应条件。关于DGGE方法常见问题及解决方案，邢德峰等[34]进行了详细分析与解析。

非培养鉴定技术仅适用于已知DNA（RNA）序列和相关遗传信息的微生物的快速鉴定，因而不能对未知微生物进行检测，并且无法对发酵肉制品整个菌群做出系统性分析。因此，非培养方法与传统的分离培养方法进行结合使用，更有利于反映出发酵过程中菌群多样性的真实信息。

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