微藻脂肪酸合成累积代谢基因调控的研究进展

郑胜 钱院红

摘要随着环境与能源问题的日益紧张，微藻成为生物柴油的重要原料，并且成为研究者们关注的热点。首先介绍了微藻作为生物柴油原料的优势，如生长速度快、生物量大、油脂含量多等。其次综述了关于微藻代谢途径的研究进展，分别从脂肪酸的合成和分解途径综述了人们近些年来对关键限速酶的研究进展，总结了不同限速酶取得的成果。提出采用基因沉默等方法来抑制脂肪酸的分解代谢。最后对微藻作为生物柴油原料的前景做了展望，目前已有乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）等酶被研究，但还有脂肪酸合成酶（FAS）等酶以及其他旁路途经的相关酶有待于更深入地开发和研究。

关键词微藻； 脂肪代谢； 生物柴油； 基因工程

中图分类号S181.3；Q946文献标识码A文章编号0517-6611（2014）23-07942-04

基金项目国家自然科学基金（31101009）。

作者简介郑胜（1979- ），男，山东泰安人，副教授，博士，从事生物药物与微生物耐药性、生物能源方面的研究。

收稿日期20140707随着社会經济的迅速发展，全球对能源的需求不断扩大，为了减轻地球温室效应，减小空气的污染程度，可替代石油能源的可再生清洁能源受到人们的广泛关注[1]。因为燃烧生物柴油很少增加二氧化碳的净排放，所以大力推动生物柴油的发展是一个必然的趋势。生物柴油（脂肪酸甲酯）是一种已被证明的较为成功的替代型燃料[2]，由于它的环保性和可再生性而得到了世界各国的大力发展。传统的生物柴油原料是植物油脂和动物油脂，但提供大量的植物油会对占地和粮食供应构成很大的威胁，又由于目前植物油的价格飙升，导致生物柴油产业面临困难，综上所述，发展生物柴油，原料是关键。

通过大量的研究发现，微藻可以替代植物油，因为微藻油的成分与植物油的成分相似，而且微藻中含有大量的油脂成分。近年来，微藻等引起各国关注的生物柴油原料正在被大力开发和研究。

1制备生物柴油的新型原料——微藻

微藻包括金藻纲、黄藻纲、硅藻纲、绿藻纲等类别，是自热界中光合效率最高的低等植物，种类繁多，生长迅速，分布广泛，可在高盐、高碱的水体中生长。在培养过程中，可用海水或吸收工业废气中的CO2大量培养，在工业生产中具有重要的意义。微藻是单细胞生物，呈链状、团状生长，且无根茎叶分化。与传统油料作物（大豆、高油玉米、菜油籽）相比，微藻具有显著的优点[3]：①光反应效率高，微藻通过光合作用产生的油脂比油料作物多，且其全部生物量都可以用来制取生物柴油。②含油量高，Hu等的研究表明，与油料作物中产量最高的作物相比，单位面积微藻的年产量比其还高7～23倍[4]。有些微藻的含油量高达20%～50%[5]。部分微藻的含油量还超过了微藻干重的80%，远远超过了最好的产油作物。③成本低，微藻比其他原料更易培养，用工业废水废气就能大量培养微藻，大大节约了柴油的生产成本。所以，微藻是极具潜力的生产生物柴油的原料。与此同时，大部分微藻是单细胞生物，与植物细胞相比，对微藻进行基因的改造相对较简单，更使微藻具有作为生物柴油原料的潜力。

2微藻的代谢研究

利用微藻生产生物柴油，其中提高微藻脂肪酸含量是研究的目的之一，为了实现这一目的，就需要深入地研究微藻的细胞代谢过程。该部分主要综述了目前微藻细胞代谢的研究进展。所示是微藻细胞主要的脂肪酸合成途径和三酰甘油（TAG）合成途径。

微藻脂肪TAG可能的生物合成代谢途径通过深入研究微藻的代谢途径，许多学者将目光转移到与脂肪酸的合成有密切联系的一系列关键酶上，主要包括乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）、丙二酰辅酶A（malonyCoA）、脂肪酸合成酶（FAS）等。早在1993年， Roessler等在硅藻中找到了编码乙酰辅酶A羧化酶的基因[11]。之后Dunahay等在硅藻（Cyclotella cryptica）中过量表达了该基因，但是却没有得到很好的预想效果[12]。但是在微藻的基因工程领域算是取得了一个很大的突破。2007年，Song等研究人员克隆了蓝藻脂肪酸合成途径中的ACC基因，并与特定的宿主启动子相连，通过PCR方法验证，成功地构建了蓝藻穿梭表达载体[7]。之后，该课题组进行了ACC调控微藻脂肪酸合成能力的研究，实验室目前正在筛选并转化ACC基因的丝状体微藻。Ohlrogge等将拟南芥的ACCase编码基因上连接了油菜种子的贮藏蛋白napin的特异性表达启动子，转入大油菜中表达，获得的第一代种子的ACCase活性增加了12～19倍，同时脂肪酸的含量也增加了6%[13]。闫晋飞通过电击转化法将大肠杆菌的乙酰辅酶A合成酶基因（acetylcoA synthetase，ACS）引入到海洋裂壶藻Schizochytrium sp.TIO1101中，检测结果显示：外源ACS基因表达可以增加细胞内乙酰辅酶A库存，显著提高生物量和脂肪酸含量[14]。在脂肪酸的合成过程中，另外一个重要的催化碳链加长的酶是脂肪酸合成酶（FAS），但是在国内外的研究报道中，还未见在微藻体内超表达脂肪酸合成酶的相关报告，这将成为潜在的重要研究方向。

在的Kennedy 途径中，脂肪酸在辅酶A、酰基辅酶A等酶的催化下，发生一系列的反应，最终生成了三酰甘油（TAG）。为了提高细胞内脂肪酸的积累，获得脂肪酸分泌型微藻，必须抑制脂肪酸被分解。Zou等把酵母推测编码的基因sn2 acyltransferase在甘蓝油菜中过量表达，结果发现溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAT）在转基因油菜中活性提高并且油脂含量提高到了原来的6倍左右[15]。另有研究表明，酵母的LPAT基因SLC11在拟南芥和油菜中超表达，增加了长链脂肪酸的比例和含量，并且种子的含油量增加了8%～48%[16]。既然可以超表达编码的基因，那么采用基因工程的方法来抑制LPAT的活性也是一个很有潜力的研究方向。类似地，油菜ACCase（乙酰辅酶A羧化酶）的活性通过反义表达技术被抑制，最终测得的种子的含油量明显降低[16]。Beopoulos等将从3磷酸甘油醛（G3P）转化到磷酸二羟丙酮（DHAP）的关键酶GUT2敲除，改变了代谢过程中的碳的转化方向，因此生成的酵母油脂提高了3倍[17]。Dulerhno等把负责G3P穿梭的Gpd1基因过表达，缺失酯酰辅酶A氧化镁（AOX）后细胞的油脂含量提高了34%[18]。田琪琳等利用反向载体技术构建了莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（pepc2）基因的表达载体，将其转入莱茵衣藻来获得pepc2表达量降低的转基因突变株[19]。由此可见，利用基因敲除或沉默工具，在微藻代谢途径中抑制相关酶基因的表达也是一种有效的提高脂肪酸积累的方法。这为进一步筛选高含油量的基因工程微藻提供了基础材料。

同样，二酰基甘油酰基轉移酶（DGAT）是TAG合成的关键酶，所以，采用反义表达技术抑制DGAT的活性，也可能会实现积累脂肪酸的目的，在目前的研究中，BouvierNave等将拟南芥的DGAT基因在烟草（N.tabacum）和酵母中超表达，DGAT的活性增加了200多倍[20]。研究表明，红花和大肠杆菌甘油三磷酸酰基转移酶（GPAT）基因在拟南芥中超量表达，提高了种子的重量和含油量，含油量增加了8%～29%[21]。

在微藻的研究中，硅（Thalassiosira pseudonana）和绿藻（Ostreococcus tauri）的DGAT基因已经被克隆和表达，莱茵衣藻的DGAT基因的研究也在进行中。近几年，王娟飞等成功完成了三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）丙酮酸磷酸二激酶（PPDK）基因和PPDKiSe载体的构建[22]。随后，朱聪聪等利用电穿孔法，成功构建了三角褐指藻的叶绿体表达体系[23]。刘玉等通过PCR验证，成功构建了栗酒裂殖酵母丝氨酸蛋白激酶（CDC2）基因的淡水舟形藻表达载体[24]。这些试验操作复杂，对专业具有很高的严格性，但是学者们还是努力去尝试，并且得到理想的结果，这对微藻脂肪酸的积累提供了一个很有价值的参考。

最近又发现了一种新的增加藻类油脂含量的方法——混合培养法。例如，Cheirsilp等用混合培养的方式培养小球藻和粘红酵母，培养5 d后发现油脂含量达到2.88 g/L[25]。苗金鑫等用类似方法培养螺旋藻和粘红酵母，油脂产量效果达到216 mg/L[26]。混合培养技术相对简单，操作方便，也是一种很有前景的培养油脂微藻的方法。

安徽农业科学2014年3总结与展望

用微藻作为原料生产生物柴油的主要过程就是大量合成积累微藻中的脂肪酸，提取出来生产生物柴油。积累脂肪酸的途径和方法主要包括以下3个方面。①生化代谢调控。通过生化调控来积累脂肪酸，通常采用的手段是限制藻类生长的营养元素，比如氮源等。相关研究综述有秦松等[27]的微藻生物柴油技术的研究进展。但是这个方法有个弊端，就是限制了细胞的正常生长和繁殖，可能会影响脂肪酸在细胞体内的积累。②基因工程技术。微藻的基因工程手段已经很成熟，目前，已经成功地在绿藻和硅藻[28]中利用基因枪法将叶绿体和线粒体的基因进行传导[29]。其他能将外源DNA导入微藻细胞的技术包括玻璃珠法、金刚砂法、电击法等[30-31]。在最近微藻研究中，微藻（Dunaliella salina）外源基因的表达采用了在载体中加入核基质结合区（MARs）的方式提高了基因的表达水平[32-33]。在高等植物的研究中，这样只增强脂肪酸的合成并没有导致TAG成倍增加，但是在微藻中这个方法是否可靠还有待于进一步实践来验证。③基因工程和生化调控双管齐下。将两种方法结合在一起的仅见于大肠杆菌的一篇报道。今后在微藻中将两者结合研究，也许微藻的脂肪酸积累会达到更好的效果。

目前，微藻中已知的可调控酶包括：乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）、ACC、DGAT、GPAT、LPAT、PEPC等，有待于进一步研究的还有脂肪酸合成酶（FAS）、酰基辅酶A（acylCoA）以及其他未知旁路途经的相关酶等。藻类的种类很多，目前研究到的只是个别藻类，还有更多潜在的微藻研究对象。相信未来微藻生产生物柴油会有更好的研究进展。

参考文献

[1] LOTERO E，GOODWIN J，BRUCE D A，et al.The catalysis of biodiesel synthesis[J].Journal of Catalysis，2006，19（1）：41-83.

[2] 纪威，符太军，姚亚光，等.柴油机燃用乙醇-柴油-生物柴油混合燃料的试验研[J].农业工程学报，2007，23（3）：180-185.

[3] 童牧，周志刚.新一代生物柴油原料——微藻[J].农业工程技术，2009，5：19-24.

[4] HU Q，SOMMERFELD M，JARVIS E，et al.Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production：perspectives and advances[J].Plant Journa，2008，54（4）：621-639.

[5] SPOLAORE P，JOANNISO ANNISCASSAN C，DURAN E，et al.Commercial applications ofmicroalgae[J].Biosci Bioeng，2006，101：87-96.

[6] 姚茹，徐新华，张林，等.微藻的高油脂化技术研究进展[J].化学进展，2010，22（6）：1225-1227.

[7] SONG D H，HOU L J，SHI D J.Exploitation and utilization of rich lipidsmicroalgae，as new lipids feedstock for biodiesel productiona review[J].Chin J Biotech，2008，24（3）：341-348.

[8] ROSENBERG J N，OYLER G A，WIKINSON L，et al.A green light for engineered alage：redirecting metabolism to fuel a biotechnology revolution[J].Curr Opin Biotech，2008，19：430-436.

[9] COURCHESNE N M D，PARISIEN A，WANG B，et al.Enhancement of lipid production using biochemical，genetic and transcription factor engineering approaches[J].J of Biotechnol，2009，141（1/2）：31-41.

[10] LEONBANARES R，GONZALEZBALLESTER D，GALVAN A，et al.Transgenic microalgae as green cell-factories[J].Trends in Biotechnology，2004，22：45-52.

[11] ROESSLER P G，OHLROGGE J B.Cloning and characterization of the gene that encodes acetylcoenzyme A carboxylase in the alga Cyclotella cryptic[J].The Journal of Biological Chemistry，1993，268：19254-19259.

[12] DUNAHAY T G，JARVIS E E，ROESSLER P G.Genetic transformation of the diatoms Cyclotella cryptic and Navicula saprophila[J].Journal of Phycology，1995，31：1004-1011.

[13] OHLROGGE J B，ROESLER K R，SHORROSH B S.Methods of increasing oil content of seeds：United States， 5925805[P].1999.

[14] 闫晋飞.利用基因工程手段提高两种微藻的生物量与特定代谢产物产量[D].沈阳：沈阳药科大学，2013.

[15] ZOU J，KATAVIC V，GIBLIN E M，et al.Modication of seed oil content and acyl composition in the Brassicaceae by expression of a yeast sn-2 acyltransferase gene[J].Plant Cell，1997（9）：909-923.

[16] SELLWOOD C，SLABAS A R，RAWSTHORNE S.Effects of manipulating expression of acetylCoA carboxylase I in Brassica napus L. embryos[J].Biochem Society，2000，28：598-600.

[17] BEOPOULOS A，MROZOVA Z，THEVENIEAU F，et al.Control of lipid accumulation in the yeast Yarrowia lipolytica[J].Appl Environ Microbiol，2008，74（24）：7779-7789.

[18] DULERMO T，NICAUD J M.Involvement of the G3P shuttle and betaoxidation pathway in the control of TAG synthesis and lipid accumulation in Yarrowia lipolytica[J].Metab Eng， 2011，13（35）：482-491.

[19] 田琪琳，施定基，賈晓金等.“细菌型”pepc2基因反向表达载体构建及在莱茵衣藻中的表达[J].上海海洋大学学报，2013（5）：665-671.

[20] BOUVIERNAVE P，BENVENISTE P，OELKERS P，et al.Expression in yeast and tobacco of plant cDNAs encoding acyl CoA：diacylglycerol acyltransferase[J].European Journal of Biochemistry/FEBS，2000，267（1）：85-96.

[21] JAIN R K，COFFEY M，LAI K，et al.Enhancement of seed oil content by expression of glycerol3phosphate acyltransferase genes[J].Biochem Soc Trans，2000，28（6）：958-961.

[22] 王娟飞，陈志森，陈军.三角褐指藻PPDK基因RNAi载体的构建和基因枪转化[J].厦门大学学报：自然科学版，2010，49（5）：400-405.

[23] 朱聪聪，张乃升，谢伟红，等.叶绿体转化三角褐指藻表达外源蛋白[J].热带亚热带植物学报，2011，19（3）：267-272.

[24] 刘玉，朱万鹏，王莹莹，等.栗酒裂殖酵母CDC2基因克隆及淡水舟形藻表达载体构建[J].生物技术通报，2013（12）：108-112.

[25] CHEIRSILP B，SUWANNARAT W，NIYOMDECHA R.Mixd culture of oleaginous yeast Rhodotorula glutinis and microalga Chlorella vulgaris for lipid production from industrial wastes and its use as biodiesel feedstock[J].N Biotechnol，2011，28（4）：362-368.

[26] 苗金鑫，薛飞燕，张栩，等.粘红酵母和钝顶螺旋藻混合培养生产微生物油脂培养基优化[J].生物加工过程，2007（3）：27-31.

[27] 姜進举，苗凤萍，冯大伟，等.微藻生物柴油技术的研究现状及展望[J].中国生物工程杂志，2010，30（2）：134-140.

[28] KROTH P G.Genetic transformation：a tool to study protein targeting in diatoms[J].Methods Mol Bio，2007，390：257-268.

[29] REMACLE C，CARDOL P，COOSEMANS N，et al.High-efficiency biolistic transformation of Chlamy domonasmit ochondria can be used to insertmutations in complex I genes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（12）：4771-4776.

[30] SUN Y，YANG Z Y，GAO X S，et al.Expression of foreign genes in Dunaliella by electroporation[J].Molecular Biotechnology，2005，30（3）：185-192.

[31] WANG C H，WANG Y Y，SU Q，et al.Transient expression of the GUS gene in a unicellularmarine green alga，Chlorellasp MACC/C95，via electroporation[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering，2007，12（2）：180-183.

[32] SCHENK P M，THOMASHALL S R，STEPHENS E，et al.Second generation biofuels：highefficiency microalgae for biodiesel production[J].Bioenerg Res，2008，1：20-43.

[33] WANG T Y，XUE L X，HOU W H，et al.Increased expression of transgene in stably transformed cells of Dunaliella salina by matrix attachment regions[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2007，76（3）：651-657.