响应面法优化黑木耳酸性多糖硫酸酯化制备工艺

尹红力 佟丽丽 王振宇 李婷婷 刘冉

摘要 前期研究发现，硫酸酯化黑木耳酸性多糖具有较好的生物活性，运用响应面法对黑木耳酸性多糖的最佳硫酸酯化工艺条件进行优化研究。研究了氯磺酸与N，N-二甲基甲酰胺的体积比、酯化试剂的体积含量、反应温度、反应时间、转速5个因素对黑木耳多糖硫酸酯化取代度的影响。利用最陡爬坡试验逼近因素的最大响应区域，采用Box-Behnken设计法对各因素的水平组合进行优化，获得黑木耳酸性多糖硫酸酯化优化条件：氯磺酸∶N，N-二甲基甲酰胺为1∶3.49、酯化试剂比例为33%、反应温度50 ℃、反应时间112.84 min、转速为200 r/min，在此优化条件下硫酸酯化黑木耳酸性多糖的取代度可达0.490 5。

关键词 黑木耳酸性多糖；硫酸酯化；响应面法；工艺条件优化

中图分类号 S646.6 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）26-09167-05

Study on the Optimization of Acid Auricularia Auricular Polysaccharides Sulfate Esterification Process by Response Surface Methodology

YIN Hong-li et al （Department of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract Previous studies have found that sulfate esterification Auricularia auricular acidic polysaccharides has good biological activity. Response surface methodology was adopted to optimize sulfuric acid esterification process conditions for Auricularia auricular polysaccharides. Effects of the volume ratio of chlorosulfonic acid and N， N- dimethyl formamide， the volume ratio of esterification reagent， the reaction temperature， the reaction time， rotational speed on degree of substitution of the ulfatex acid esterification for polysaccharide of Auricularia auricular were studied. The path of steepest ascent was used to define optimal response region for these three factors. Optimal level combinations of factors were obtained through Box-Behnken design. The optimal sulfuric acid esterification process conditions for polysaccharide of Auricularia auricular were as follows： the volume ratio of chlorosulfonic acid and N， N dimethyl formamide is 1∶3.49， the volume ratio of the esterification reagent is 33%， the reaction temperature is 50 ℃， the reaction time is 112.84 min， rotational speed is 200 r/min. Under optimal sulfuric acid esterification conditions， the DS of polysaccharide reached 0.490 5.

Key words Auricularia auricular acidic polysaccharides； Sulfuric acid esterification； Response surface methodology； Process conditions optimization

多糖（polysaccharide，簡称PS）是一类具有广泛生物活性的生物大分子物质，目前已有300多种多糖类化合物从天然产物中被分离^[1]。研究表明，黑木耳多糖具有许多重要的生理功能，如降血糖^[2-3]、降血脂^[4-5]、抗肿瘤^[6-7]、抗衰老^[8]、提高机体免疫等功能。硫酸酯化多糖 （Sulfated Polysacchides）除已证实具有抗凝血^[9]作用外，近年来不断发现它有多种生物活性，如抗病毒的活性^[10]、提高多糖的免疫调节活性^[11-12]、抗氧化能力^[13]、抗肿瘤^[14]活性。目前研究了黑木耳多糖硫酸酯化在药用价值、分离纯化等方面的应用^[15]，而对黑木耳酸性多糖的硫酸酯化制备工艺以及生理活性作用方面的研究还未见报道。前期研究发现，硫酸酯化黑木耳酸性多糖具有更好的生物活性，为了增强其功能性质，笔者对黑木耳酸性多糖硫酸酯化修饰进行了优化试验。

多糖硫酸酯的抗病毒活性、降血糖活性等与分子量、硫酸基取代度、糖苷键结构、给药途径等有关^[16]，其中取代度是主要的影响因素，因为硫酸基的引入可以改变多糖的立体构象，而构象的改变往往是生物活性变化的决定因素。因此，笔者以取代度为相关因素进行评估，通过该研究获得高取代度的硫酸酯化黑木耳酸性多糖，从而为黑木耳资源的开发利用，以及开发新品种的保健因子、保健食品或药品等应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 供试原料：黑木耳，黑龙江省海林市北味黑木耳。主要试剂：氯磺酸、N，N-二甲基甲酰胺、无水甲酰胺、乙醇、明胶（生化试剂），上海化学试剂采购供应站；氯化钡、浓盐酸、无水硫酸钠、三氯乙酸和氢氧化钠均为分析纯。

主要仪器：RE52-3旋转蒸发仪、JB50-D型增力电动搅拌器、Spectru mlab53紫外可见分光光度计、EMS-8A加热磁力搅拌器，天津欧诺仪器仪表有限公司；ALC-110.4电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；TDA-8002水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；756PC型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；FD-18真空冷冻干燥机，上海田枫实业有限公司；BSZ-100自动部分收集器，上海泸西分析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑木耳酸性多糖的制备。

原料预处理→0.1 mol/L NaCl热水浴浸提（料液比1∶50 g/ml、提取温度为80 ℃、提取时间4 h）→离心（4 000 r/min，10 min）→上清液抽滤→用1 mol/L HCl调pH至7.0→浓缩→3%H₂O₂脱色→Sevage法除蛋白（氯仿∶正丁醇=4∶1；Savage试剂∶多糖溶液=1∶4）→醇沉24 h→离心→复溶→透析→冻干→多糖粗品。

多糖粗品过纤维素DEAE-52柱，分别用0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L NaCl洗脱，收集0.2 mol/L NaCl洗脱液，旋转蒸发，透析，冻干后得到黑木耳酸性多糖。

1.2.2 磺酸化试剂制备。

准确量取一定体积N，N-二甲基甲酰胺置于附有冷凝装置的三颈瓶中，然后将三颈瓶置于冰水浴中，并用铁架台固定，于磁力搅拌器上搅拌。用胶头滴管以缓慢的速度将氯磺酸滴入N，N-二甲基甲酰胺中，制备得到氯磺酸∶N，N-二甲基甲酰胺的磺酸化试剂，整个过程持续2～3 h。

1.2.3 黑木耳酸性多糖硫酸酯化的制备。

称取一定真空冷冻干燥的黑木耳酸性多糖，溶于无水甲酰胺中，加入一定量的磺酸化试剂，在一定温度及转速条件下振荡一段时间，反应结束后，迅速冷却至室温，加入3倍体积95%乙醇進行醇沉24 h。离心后取沉淀，用60%乙醇洗涤3次，将沉淀溶于50 ml蒸馏水中，搅拌后用1 mol/L NaOH溶液调节pH至7.0，然后流水透析（3 500 Da）48 h，蒸馏水透析24 h。真空浓缩，醇沉，冷冻干燥得硫酸酯化黑木耳酸性多糖。得率计算公式如下：

1.2.4 取代度测定（DS）。

氯化钡-明胶浊度法：取0、0.04、0.08、0.12、0.16和0.20 ml硫酸钠于具塞试管中，补加1 mol/L HCl至0.20 ml，分别加入3.8 ml 3%三氯乙酸（W/V）和1.0 ml氯化钡-明胶混匀后静置15 min。

以不含标液的0号管为空白，测360 nm吸光值，得硫含量与吸光度值之间的线性关系为：y=0.002 7x+0.005 2，其中相关系数R2=0.999 2符合要求。表明硫含量在设定的浓度范围内与吸光值呈良好的线性关系，符合朗伯比尔定律。

称取硫酸酯化衍生物4.5 mg于具塞试管中，加4.5 ml 1 mol/L HCl，100 ℃下水解2.5 h，冷却至室温后取0.2 ml进行测定，后续同标准曲线。

样品取代度的计算：

DS=1.62×S%/（32-1.02×S%）

式中，DS 表示取代度；S%为样品中硫的含量^[17]。

1.2.5 取代度的优化试验设计。

根据单因素试验的结果，利用Plackett-Burman设计，以硫酸酯化多糖取代度作为考察指标，对相关因素进行评估，筛选出具有显著效应的几个因素。根据其试验结果，在此基础上，利用最陡爬坡试验逼近以上3个因素的最大响应区域。采用Box-Behnken中心组合试验设计原理，选择对多糖取代度影响大的几个因素进行优化试验。

2 结果与分析

2.1 单因素条件的确定

2.1.1 反应温度对硫酸酯化黑木耳酸性多糖取代度的影响。

从图1中可看出，黑木耳酸性多糖硫酸酯化中硫酸基取代度随酯化温度的升高呈先增大后减少的变化趋势，当反应温度升高超过50 ℃，DS开始下降，表明升高温度有利于硫酸酯化反应的充分进行，但温度升高超过一定程度后，在高温环境下副反应占主导地位。由此得出，最佳反应温度为50 ℃。

Plackeet-Burman主效应分析表中，Pr>|t|值表示其对应因素的显著性，在95%的水平上，Pr>|t|值<0.05表示显著。T检验值的大小显示出因素对试验结果影响的大小。通过Plackeet-Burman因素水平及主效应分析，选取影响显著的3个因素作为最陡爬坡试验的研究对象。

由表3可知，在试验因素对硫酸酯化多糖取代度影响的试验中， D对硫酸酯化多糖取代度产生正效应，A对硫酸酯化多糖取代度产生负效应。因素A、D的影响显著，C次之，由于这几个因素对取代度影响显著，选择其作为后续研究的因素。综合以上分析，选取因素A、C、D作为最陡爬坡试验的研究因素。

2.3 最陡爬坡试验设计（Steepest ascent design）及结果

根据“2.2”的Plackett-Burman试验分析的结果，综合因素的正负效应确定其变化的方向，并缩小步长，进行最陡爬坡试验，具体的试验设计及结果见表4。

3 结论

该试验优化后确定的硫酸酯化黑木耳酸性多糖的最优制备条件为： 反应温度50 ℃、反应时间112.84 min、酯化试剂比例为33%、氯磺酸∶N，N-二甲基甲酰胺为1∶3.49、转速为200 r/min。在最优工艺条件下进行验证试验，测得取代度为0.490 5，这与理论值误差较小。所以，利用响应面法优化得到硫酸酯化黑木耳酸性多糖的制备条件真实可靠，能够为黑木耳酸性多糖硫酸酯化衍生物在保健因子、功能性食品或药品领域中的应用提供理论依据，在实践中具有指导意义。

目前研究了硫酸酯化黑木耳多糖在药用价值、分离纯化等方面的应用，而对黑木耳酸性多糖的硫酸酯化制备工艺以及生理活性作用方面的研究还未见报道。该研究为黑木耳资源的开发利用，以及开发新品种的保健因子、保健食品或药品等应用奠定了理论基础。

参考文献

[1]王彦军.中药多糖研究进展[J].医学理论与实践，2009，22（3）：360-362.

[2] 宗灿华，于国萍.黑木耳多糖对糖尿病小鼠降血糖作用[J].食用菌，2007，29（4）：60-61.

[3] 韩春然，马永强，唐娟.黑木耳多糖的提取及降血糖作用[J].食品与生物技术学报，2006，25（5）：111-114.

[4] 王献友，陈培云，吴广臣，等.黑木耳多糖提取及其药理活性的研究进展[J].南方农业学报，2012，43（5）：683-687.

[5] 孙畅，姜明，段旭彤，等.黑木耳的保健和药用价值以及开发前景分析[J].科技视界，2012，5（1）：17-18.

[6] MISAKI A，KAKUTA M.Studies on interrelation of structure and anti tumor effeets of polysaccharides： antitumor action of periodatemodifled branched（1-3）-β-D-glucan of Auricularia Auricula-judae，and polysaccharides confaining（l-3）.glyeosidielinkages[J].CarbohydrateReseareh，1981，92：115-120.

[7] 左江成，高宝安，曾一芹，等.黑木耳多糖对人红白血病K562细胞周期和凋亡的影响[J].中成药，2010，32（5）：727-730.

[8] 朱磊，王振宇.黑木耳多糖对小鼠抗疲劳作用的研究[J].营养学报，2008，30（4）：430-432.

[9] LU Y，WANG D，HU Y，et al. Sulfated modification of epimedium polysaccharide and effects of the modifiers on cellular infectivity of IBDV[J].Carbohydrate Polymers，2008，71（2）：180-186.

[10] LIU C， CHEN H， CHEN K，et al.Sulfated modification can enhance antiviral activities of Achyranthes bidentata polysaccharide against porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） in vitro[J].International Journal of Biological Macromolecules，2013，52：21-24.

[11] ZHANG Y L，ZHANG J B，MO X Y，et al.Modification，characterization and structure-anticoagulant activity relationships of persimmon polysaccharides[J].Carbohydrate Polymers，2010，82（2）：515-520.

[12] CHAN WK，LAW H K W，LIN Z，et al.Response of human dendritic cells to different immunomodulatory polysaccharides derived from mushroom and barley[J]. International Immunology，2007，19（7）：891-899.

[13] MA L S，CHEN H X，ZHANG Y，et al.Chemical modification and antioxidant activities of polysaccharide from mushroom Inonotus obliquus[J].Carbohydrate Polymers，2012，89（2）：371-378.

[14] WEI D F，WEI Y X，CHENG W D，et al.Sulfated modification， characterization and antitumor activities of Radix hedysari polysaccharide[J].International Journal of Biological Macromolecules，2012，51（4）：471-476.

[15] 李公斌，王振宇.黑木耳多糖硫酸酯化制備工艺及红外光谱分析[J].东北林业大学学报，2008，36（12）：66-68.

[16] STONE A L， MELTON D J， LEWIS M S. Structure-function relations of heparin-mimetic sulfated xylan oligosaccharides inhibition of human immunodeficiency virus-1 infectivity in vitro[J].Glycocon-jugate Journal， 1998，15（7）：697-712.

[17]ZHANG H F，LI B C，FAN J H.Determination of sulfate radical content in sulfated polysaccharides （SPS） by gravimetric analysis of hydrochloric acid hydrolysis and barium sulfate precipation[J].Food Sci，2002，23（5）：107-111.