嘉兴地区秸秆降解菌的资源调查（I）：部分霉菌的分类鉴定

叶童童 张孙燕 何杜鹃 于建兴 李加友

摘要 [目的]对嘉兴地区秸秆降解菌部分霉菌分类鉴定。[方法]利用形态分类学方法和基于ITS序列的分子鉴定，对环境中原位分离的15种秸秆降解霉菌进行分类鉴定。[结果]1228属于哈茨木霉；1105、1012属于黑曲霉的不同菌株；1210、1234属于塔宾曲霉的不同菌株；1219属于赭曲霉；1021、1106、1110、1222、1229、1230、1232属于卷枝毛霉的不同菌株；1237属于米根霉；1109属于球毛壳菌。[结论]通过对秸秆降解菌的资源调查，为高性能秸秆降解菌的选育奠定基础。

关键词 秸秆降解菌；形态学鉴定；ITS序列；嘉兴地区

中图分类号 S181.3 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）26-09107-04

Investigation of Straw-degradation Strains in Jiaxing （I）： Identification of Some Molds

YE Tong-tong， LI Jia-you et al （College of Biological and Chemical Engineering， Jiaxing University， Jiaxing， Zhejiang 314001）

Abstract [Objective] The research aimed to identify some molds decomposing straw in Jiaxing. [Method] By morphological taxonomy method and molecular identification based on ITS sequence， 15 kinds of straw-degradation molds in situ separating from the environment were identified. [Result] Strain 1228 belonged to Hypocrea lixii； strains 1105 and 1012 belonged to Aspergillus niger； strains 1210 and 1234 belonged to Aspergillus tubingensis； strain 1219 belonged to Aspergillus ochraceus； strains 1021， 1106， 1110， 1222， 1229， 1230 and 1232 belonged to Mucor circinelloides； strain 1237 belonged to Rhizopus oryzae； strain 1109 belonged to Chaetomium globosum. [Conclusion] Via resource survey on straw-degradation strains， it could lay foundation for breeding high-performance straw-degradation strains.

Key words Straw-degradation strain； Morphological identification； ITS sequence； Jiaxing

我国年产水稻秸秆1.8亿t，其中资源化利用率不超过50%，大量水稻秸秆被废弃或就地焚烧，对农村环境和空气质量造成严重污染^[1]。利用生物发酵的方法可以将水稻秸秆转化为燃料乙醇、饲料、栽培基质和有机肥等^[2]，但由于生物转化效率低，发酵周期长，影响了水稻秸秆的资源化利用和产品开发。水稻秸秆主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素，能以水稻秸秆为基质的微生物包括多种细菌、霉菌等，其中霉菌最为常见和常用。自然环境中就存在大量可以降解水稻秸秆的微生物菌株，并且不同地区的水稻秸秆降解菌種类各异，现有的水稻秸秆降解菌基本都是从自然环境中筛选获得^[3]。因此，开展天然水稻秸秆降解菌资源调查研究对水稻秸秆生物降解技术的发展具有意义。

1 材料与方法

1.1 秸秆 取自嘉兴地区不同水稻种植单位的秸秆样品10份，自然风干后粉碎过筛备用，筛孔直径1 mm。

1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 ml，pH自然，121 ℃灭菌20 min。沙堡氏液体培养基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，水1 000 ml，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

1.3 分子鉴定用试剂

Ezup 柱式基因组DNA抽提试剂盒（真菌）、琼脂糖H、DNA marker F、PCR试剂、SanPrep 柱式DNA胶回收试剂盒均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。其中PCR上下游引物分别为ITS1：TCCgTAggTgAACCTgCgg，ITS4：TCCTCCgCTTATTgATATgC。

1.4 秸秆降解菌株的分离纯化

取不同来源的秸秆为培养基质，加入适量的无菌水和无机氮源，装瓶后于28 ℃恒温培养。定期检测培养瓶中秸秆表面微生物生长情况，适时将长出的菌株进行分离纯化并编号，然后将所得的纯菌株重新接种于无菌的秸秆培养基质上，选择生长状况良好的菌株作为秸秆降解菌，并保藏。

1.5 形态学分类鉴定

将斜面保存的菌种转接至PDA平板上，28 ℃恒温倒置培养1～2 d，待菌丝长出后，用接种铲铲取菌丝至新的PDA培养基上继续培养。取约0.5×0.5 cm大小的菌丝块置于铺有灭菌玻璃纸的PDA平板中央，28 ℃培养5 d 至菌丝长满平板，最后将纯化的菌丝块移至 PDA培养基上斜面培养保藏待用^[4]。

1.5.1 菌落观察。无菌条件下，用接种针挑取纯化分离斜面培养基中单菌落孢子，采用单点接种法接种于PDA培养基当中，将霉菌28 ℃培养3～5 d，观察并记录PDA平皿菌落特征，包括菌落的正背面颜色、菌落直径、菌落质地、表面、边缘、透明程度、隆起度、特殊气味、干湿情况、有无分泌物等^[5]。

1.5.2 显微观察。 制备临时玻片，从菌落的边缘挑取少许菌丝和孢子置于生理盐水中，加盖玻片。显微镜下观察并记录菌种的显微形态，包括分生孢子头、顶囊、瓶梗、梗基、产孢结构、分生孢子等^[6]。

1.5.3 菌种形态鉴定。参照《真菌鉴定手册》，根据菌落形态和显微形态观察结果，对秸秆降解菌进行分类^[7]。

1.6 ITS区序列分析 DNA提取、ITS序列扩增和PCR产物回收均参照试剂盒使用指南和文献方法。基因序列测定由上海生工完成。

1.7 生物信息分析 用 chromas 软件对PCR 产物测序图谱分析，用 lasergene 软件对 PCR 产物序列进行处理与比对，并构建分子进化树，对不同菌株的亲缘关系进行判定。最后，在NCBI上对所得序列进行 BLAST分析，通过比较与已知序列的同源程度，综合形态学特征以确定菌株的分类。

2 结果与分析

2.1 秸秆降解菌的分离纯化

对嘉兴地区不同来源的秸秆进行培养后，获得纯化的菌株103株，经过定性检测后，选取其中秸秆降解能力较强的15株霉菌进行分类鉴定，待测菌株编号分别为1012、1021、1105、1106、1109、1110、1210、1219、1222、1228、1229、1230、1232、1234、1237。

2.2 形态学鉴定

对15个菌株菌落的形状、颜色、边缘、隆起度、干湿度、特殊气味、色素、透明度、气生菌丝、孢子颜色等特征进行观察描述；同时利用显微镜观察各菌株的分生孢子头、产孢结构、顶囊、瓶梗、梗基、分生孢子等显微形态。根据《真菌鉴定手册》对15株真菌进行了初步鉴定，发现上述秸秆降解菌分别属于木霉属、曲霉属、毛霉属、根霉属、毛壳菌属。

2.2.1 曲霉属。菌株1012、1105、1210、1219、1234属于曲霉属。各菌的菌落形态基本一致，但也略有不同（表 1）。显微镜观察发现菌丝无色、淡色或表面凝集有色物质，有隔膜。分生孢子梗从足细胞垂直生出，大多数无横隔，光滑或粗糙，上部较粗大，顶端膨大成球形、椭圆形、半圆形或棒球形的孢囊；从孢囊的全部表面以放射状生出小梗或仅在孢囊顶部产生小梗；小梗单层或在顶部再分枝成2个至多个小梗。分生孢子串生于小梗顶端，作辐射状排列或丛集成柱状，着色、形状、大小和纹饰的变化很大（图 1）。初步鉴定为真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、曲霉目、曲霉科的曲霉属（Aspergillus）。

2.3 分子鉴定

2.3.1 DNA提取与检测。对15个秸秆降解菌菌株分别提取基因组DNA，进行电泳检测。结果表明，提取的DNA质量完好，可进行后续的PCR扩增试验。

2.3.2 PCR扩增与检测。以 ITS1 和 ITS4 为引物，以各菌株的 DNA 为模板，扩增ITS序列，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。对PCR产物进行切胶回收，进行电泳检测，根据 DNA marker的片段大小推测各产物大小在500～700 bp左右，不同菌株的ITS序列长度略有不同。结果表明，扩增的ITS片段纯度高，可进行测序。

2.3.3 ITS序列分析。对15种秸秆降解菌的ITS序列进行BLAST分析，由表3可知，1228属于哈茨木霉（Hypocrea lixii/Trichoderma harzianum）；1105、1012属于黑曲霉（Aspergillus niger）的不同菌株；1210、1234屬于塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）的不同菌株；1219属于赭曲霉（Aspergillus ochraceus）；1021、1106、1110、1222、1229、1230、1232属于卷枝毛霉（Mucor circinelloides）的不同菌株；1237属于米根霉（Rhizopus oryzae）；1109属于球毛壳菌（Chaetomium globosum）。其中菌株1021、1106和1110可能为新种，有待进一步深入研究。

3 结论与讨论

以菌落形态、显微形态和生理生化特征为依据的表型分类法是一种传统的分类鉴定方法，但考虑到真菌具有形态特征复杂、种类繁多等特点，且一些菌种的生理生化指标和形态特征受多种内环境及外环境因素的影响，因此对其采用传统分类方法进行分类存在较大的主观性。分子鉴定除了具有简便、快速、分辨率高等一般特点，亦可进行多相分类鉴定，更能按照种系进化的保守序列的关系精确地确定种类，使分类鉴定结果显得更加的客观合理^[9]。但是由于秸秆降解菌还在不断被开发中，受高度同源性序列的多少、基因库完善程度及具体物种ITS区的可变程度等影响，因此必须与传统的真菌形态鉴定方法结合才能取得精确的鉴定结果。

该研究综合形态学鉴定及分子鉴定，初步判断15种秸秆降解菌分别为：1228属于哈茨木霉；1105、1012属于黑曲霉的不同菌株；1210、1234属于塔宾曲霉的不同菌株；1219属于赭曲霉；1021、1106、1110、1222、1229、1230、1232属于卷枝毛霉的不同菌株；1237属于米根霉；1109属于球毛壳菌。查取各菌的相关信息，证实其确有降解纤维素或木质素的能力，对降解秸秆有重要意义，为秸秆降解菌的开发利用提供了有力的依据。并采用斜面低温保藏法及低温干燥保藏法对15种菌进行了保藏，采用麸皮培养，有利于纯化菌种，提高秸秆降解菌质量，既可以作扩大培养应用，又可用保藏菌种。这样既满足了实验室对菌种的需求，又防止了菌种的退化，对生物资源的开发利用和保护意义重大。

参考文献

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