鸡白细胞介素—18对H9亚型禽流感灭活油乳苗的免疫增强作用

郭晓庆 金钺 顾阳 潘鑫龙 乔涵 陈红英

摘要 [目的] 探索雞白细胞介素-18（IL-18）在H₉禽流感（AI）灭活油乳苗免疫中的免疫佐剂作用。[方法] 从鸡脾淋巴细胞中克隆鸡IL-18基因，亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+）中，构建真核表达质粒pIL-18。将重组真核表达质粒pIL-18、H₉亚型AI灭活油乳苗及其二者联合分别免疫14日龄SPF鸡，检测其细胞免疫和体液免疫水平，评价鸡IL-18在H₉亚型禽流感灭活油乳苗中的免疫增强作用。[结果]成功克隆了鸡IL-18全基因，大小为597 bp。质粒pIL-18和H₉亚型AI灭活油乳苗联合免疫的SPF鸡所产生的HI抗体效价在接种第4周后明显高于H₉亚型AI灭活油乳苗免疫组；其T淋巴细胞的增殖反应也强于H₉亚型AI灭活油乳苗免疫组。[结论] 质粒pIL-18能提高H₉亚型禽流感灭活油乳苗诱发的免疫应答，为研究防制禽流感的新型疫苗提供了新思路。

关键词 鸡白细胞介素-18；真核表达；H₉亚型禽流感病毒；灭活疫苗

中图分类号 S831 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）26-09048-03

Immune Enhancement Effects of Chicken Interleukin-18 on Inactivated Oil Emulsion Vaccine of H₉Subtype Avian Influenza

GUO Xiao-qing， CHEN Hong-ying et al （College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Henan Agricultural University， Zhengzhou， Henan 450002）

Abstract [Objective] The research aimed to explore the immune adjuvant effect of interleukin-18（IL-18） in the immunization of inactivated oil emulsion vaccine of H₉subtype avian influenza. [Method] Chicken IL-18 gene was amplified from total RNA extracted from chicken spleen lymphocytes. PCR product was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.1（+） to construct eukaryotic expression vector pIL-18. The recombinant eukaryotic expression vector pIL-18， inactivated oil emulsion vaccine of H₉subtype avian influenza and the mixture were used to immunize 14-day-old SPF chicken and detect its cellular immunity and humoral immunity levels. The immune enhancement effects of chicken on inactivated oil emulsion vaccine of H₉subtype avian influenza were evaluated. [Result] Total IL-18 gene of chicken was successfully cloned， and its length was 597 bp. The titers of HI antibody produced in SPF chicken immunized with plasmid pIL-18 and inactivated oil emulsion vaccine of H₉subtype avian influenza in the four weeks after inoculation were obviously higher than that in inactivated oil emulsion vaccine of H₉subtype avian influenza. Its multiplication response of T lymphocyte was stronger than that in inactivated oil emulsion vaccine of H₉subtype avian influenza group. [Conclusion] Plasmid pIL-18 could enhance the immune response induced by inactivated oil emulsion vaccine of H₉subtype avian influenza， which provided a new thought for studying and developing new vaccines of avian influenza.

Key words Chicken interleukin-18； Eukaryotic expression； H₉subtype avian influenza virus； Inactivated vaccine

近年来，由H₉亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的禽流感（Avian influenza，AI）在我国部分地区广泛流行，给养禽业造成了严重的经济损失。油乳剂灭活苗虽然对该亚型禽流感的控制发挥了重要作用，但是其免疫效力尤其细胞免疫作用受到了限制；弱毒疫苗存在潜在的安全问题；基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗虽具有应用潜力，但也需要提高其免疫、尤其细胞免疫效果。

白细胞介素-18（IL-18）又称为IFN-γ诱导因子（Okamura et al.，1995），具有多种生物学功能。它能刺激Th1等细胞产生IFN-γ、GM-CSF、IL-2等细胞因子，增强Fas介导的细胞毒作用，促进T细胞的增殖，因此IL-18在抗病毒、抗肿瘤、抗超敏反应等方面具有潜在的应用前景^[1-3]。鸡IL-18与IL-18具有相同的功能，是一种新型的细胞免疫调节因子，可以显著刺激Thl细胞产生IFN-γ^[4-6]。国内尽管也有人

研究鸡IL-18重组真核表达质粒对鸡用疫苗的免疫增强作用^[7]，但与国外研究相比较，目前国内尚未见到鸡IL-18重组真核表达质粒对H₉亚型AI灭活油乳苗免疫增强作用的研究报道。笔者从鸡脾淋巴细胞中克隆鸡IL-18基因，亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+）中，构建真核表达质粒pIL-18。将重组真核表达质粒pIL-18、H₉亚型AI灭活油乳苗及其二者联合分别免疫14日龄SPF鸡，检测其细胞免疫和体液免疫水平，以评价鸡IL-18在H₉亚型禽流感灭活油乳苗中的免疫增强作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、抗原及主要试剂。

Ex Taq DNA聚合酶、DNA marker DL2000、限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ等，均购自宝生物工程（大连）有限公司。QIAQuick Gel Extraction Kit为Qiagen公司产品。动物总RNA快速提取试剂盒（Trizol-离心柱法）为上海捷瑞生物工程有限公司产品。Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit为ThermoFisher Scientific公司产品。真核表达质粒pcDNA3.1、LipofectamineTM 2000 Reagent均购自Invitrogen公司。细胞培养基DMEM购自Gibco BRL公司。刀豆素（ConA）、甲基噻唑基四唑（MTT）试剂和淋巴细胞分离液等均购自北京索莱宝科技有限公司。H₉亚型AI灭活油乳苗和H₉亚型禽流感HA抗原均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.1.2 试验鸡。

1日龄SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，试验期间饲养于隔离器中。

1.2 重组质粒的构建及大量制备

采用動物总RNA快速提取试剂盒从鸡脾淋巴细胞中提取总RNA，根据Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit使用说明书反转录为cDNA，使用鸡IL-18特异引物^[8]扩增鸡IL-18全基因。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切回收的PCR产物，电泳、分离和回收0.6 kb的鸡IL-18片段，定向插入到同样处理的真核表达载体pcDNA3.1中，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL-18（简称pIL-18），转化E.coli JM109感受态细胞。将通过PCR和酶切鉴定初步鉴定为阳性的重组质粒进行测序，以验证目的基因的核苷酸序列及阅读框架的正确性。

将含有重组质粒pIL-l8的细菌扩大培养，用碱裂解法提取质粒DNA，聚乙二醇纯化。使用紫外分光光度计测定其含量，-20 ℃下保存备用。

1.3 试验动物分组及免疫

将120只14日龄SPF鸡随机分成4组，30羽/组：Ⅰ组为单疫苗免疫组，用H₉亚型AI灭活油乳苗后颈皮下注射SPF鸡，0.5 ml/羽；Ⅱ组为质粒pIL-l8与疫苗联合免疫组，将H₉亚型AI灭活油乳苗于后颈部皮下注射SPF鸡，同时于腿部肌肉多点注射质粒pIL-l8，200 μg/羽；Ⅲ组为pIL-l8质粒免疫组，于腿部肌肉多点注射质粒pIL-l8，200 μg/羽；Ⅳ组为质粒pcDNA3.1（+）对照组，于腿部肌肉多点注射质粒pcDNA3.1（+），200 μg/羽。免疫后第1、2、3、4、5和6周，随机抽取每组5只鸡进行翅静脉采血，分离血清，-20 ℃下保存备用。

1.4 淋巴细胞转化试验（MTT法）

免疫后1～6周，每周随机无菌心脏采集每组5只鸡肝素抗凝血2 ml，参考文献[8]中方法进行鸡淋巴细胞转化试验。

1.5 微量血凝抑制试验

采用微量血凝抑制（Hemagglutination inhibition，HI）试验^[9]，对采集的新鲜鸡血清进行HI抗体效价检测。

1.6 数据统计与分析 利用SPSS软件包采用方差分析法对试验数据进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 鸡IL-18基因的扩增

应用鸡IL-18特异性引物，通过RT-PCR扩增出鸡IL-18全基因，电泳出现1条约600 bp大小的DNA带（图1），与预期扩增片段大小相符。测序结果表明，鸡IL-18全长为597 bp，包含1个完整的开放阅读框，其核苷酸序列与Schneider等^[4]报道的鸡IL-18基因核苷酸序列同源性为100%。

2.2 鸡IL-18真核表达质粒对H₉亚型禽流感HI抗体的影响

从图2可以看出，质粒pIL-l8与疫苗联合免疫组和单疫苗免疫组的HI抗体水平从免疫后第1周迅速升高，第4周达到高峰，此后又逐渐下降，直到第6周仍处于较高水平。免疫后前3周内，pIL-18质粒和H₉亚型AI灭活油乳苗联合免疫的SPF鸡，其HI抗体效价与H₉亚型AI灭活油乳苗免疫SPF鸡的HI抗体效价无显著差异（P>0.05），但是在免疫接种第4周后，二者差异显著（P< 0.05），而pIL-18组和pcDNA3.1（+）组一直处于未免疫的抗体水平，第4周后逐渐下降至0。

2.3 鸡IL-18表达质粒对鸡的安全性和脾T淋巴细胞增殖反应的影响

在免疫后的不同时期，分别采取每组SPF鸡外周抗凝血，分离T淋巴细胞，经ConA刺激后应用MTT法测定T淋巴细胞的增殖动态。从图3可以看出，免疫第3～6周，pIL-18和H₉亚型AI灭活油乳苗联合免疫组的OD值明显高于H₉亚型AI灭活油乳苗免疫组，差异极显著（P<0.01）；pIL-l8质粒免疫组的OD值也显著高于注射pcDNA3.1（+）组（P<0.05）。这表明用质粒pIL-18与H₉亚型AI灭活油乳苗联合免疫，比单用H₉亚型AI灭活油乳苗免疫SPF鸡T淋巴细胞转化功能有明显提高。

3 讨论

IL-18是1995年新发现的一种重要细胞因子，能诱导Th1等细胞产生大量IFN-γ的表达来提高机体免疫应答，尤其是细胞免疫应答，而且其诱导IFN-γ产生的能力比IL-12强，可以直接激活IFN-γ的启动子，因此IL-18可作为疫苗的免疫佐剂。笔者从鸡脾淋巴细胞中克隆出鸡IL-18基因，并将鸡IL-18基因重组到真核表达质粒pcDNA3.1（+）中，成功构建真核表达质粒pIL-18，为鸡IL-18功能蛋白的有效表达及其对禽用疫苗的免疫增强作用奠定了基础。

该试验结果表明构建的质粒pIL-18与H₉亚型AI灭活油乳苗联合免疫SPF鸡所产生的HI抗体效价，在接种后的前3周内与H₉亚型AI灭活油乳苗免疫组虽无明显差异（P>0.05），但在接种后第4、5及6周差异显著（P<0.05）；同时，T淋巴细胞的增殖反应从接种后第3周开始即与H₉亚型AI灭活油乳苗接种组差异明显（P<0.05），但是这种作用在接种后的2周内较弱，仅在2周后方呈现出明显的免疫增强作用，表明重组真核表达质粒DNA通过肌肉进入机体后需经过一定时间方可得到良好表达，这与Su B S等^[10]报道的相一致。这表明质粒pIL-18不仅具有明显的增强H₉亚型AI灭活油乳苗诱导细胞免疫的作用，而且对HI抗体水平的提高也具有一定的作用。另外，大量资料还表明IL-18能够增强IL-2的产生，提高NK细胞和CTL细胞的生物学活性，这些对提高疫苗的免疫效果都具有十分重要的意义。

参考文献

[1]FUJIOKA N，AKAZAWA R，OHASHI K，et al.Interleukin-18 protects mice against acute herpes simplex virus type 1 infection [J].J Virol，1999，73（2）：2401-2409.

[2] KANDA T，TANAKA T，SEKIGUCHI K，et al.Effect of interleukin-18 on viral myocarditis enhancement of interferon-gamma and natual killer cell activity [J].J Mo Cell Cardiol，2000，32（12）：2163-2171.

[3] MARSHALL D J，RUDNICK K A，MCCARTHY S G，et al.Interleukin-18 enhances Th1 immunity and tumor protection of a DNA vaccine [J].Vaccine，2006，24（3）：244-253.

[4] SCHNEIDER K，PUEHLER F，BAEUERLE D，et al.cDNA cloning of biologically active chicken interleukin-18 [J].J Interferon Cytokine Res，2000，20（10）：879-883.

[5] KAISER P.Turkey and chicken interleukin-18 （IL18） share high sequence identity，but have different polyadenylation sites in their 3' UTR [J].Dev Comp Immunol，2002，26（8）：681-687.

[6] READING P C，SMITH J L.Vaccinia virus interleukin-18-binding protein promotes virulence by reducing gamma interferon production and natural killer and T-cell activity [J].J Virol，2003，77（18）：9960-9968.

[7] 程相朝，赵德明，吴庭才，等.鸡IL-18真核表达载体的构建及其对新城疫疫苗免疫增强作用的研究[J].畜牧兽医学报，2005 ，36（5）：476-481.

[8] 陈红英，李新生，金钺，等.鸡IL-18重组真核表达载体的构建及其对ND灭活苗的佐剂作用[J].江西農业大学学报，2009，31（5）：793-797.

[9] 沈晓湖.微量红细胞凝集抑制试验技术的应用及体会[J].福建畜牧兽医，2008，30（6）：18-19.

[10] SU B S，SHEN P C，HUNG L H，et al.Potentiation of cell-mediated immune responses against recombinant HN protein of Newcastle disease virus by recombinant chicken IL-18[J].Vet Immunol Immunopathol，2011，141（3/4）：283-289.