外源铁蛋白基因NtFer对粳稻生理影响的研究

唐鑫 华张磊 姜廷波等

摘要[目的] 验证铁蛋白基因的功能，提高转基因粳稻的含铁量和转基因粳稻对盐胁迫和生物胁迫的抗性。[方法]利用农杆菌介导法将烟草铁蛋白基因NtFer1导入粳稻基因组。[结果]对T0、T1代卡那霉素抗性植株PCR、Southern杂交、Northern杂交和RT-PCR检测分析表明，外源基因已整合到粳稻基因组中，并能够稳定遗传表达。转基因粳稻超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性和叶绿素相对含量高于对照，丙二醛（MDA）含量低于对照，其根、叶片和糙米中铁含量均高于对照。接种稻瘟病病菌后转基因植株叶瘟指数低于对照。[结论] 转入外源铁蛋白基因NtFer1能够提高粳稻的含铁量和转基因粳稻对盐胁迫和生物胁迫的抗性。

关键词铁蛋白；转基因；粳稻；稻瘟病

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）23-07718-05

基金项目国家科技支撑项目（2011BAD16B11）；“十二五”农村领域国家科技计划项目（2011BAD35B02-01）。

作者简介唐鑫华（1982- ），男，黑龙江佳木斯人，实验师，在读博士，从事水稻遗传育种研究。*通讯作者，教授，博士生导师，从事水稻遗传育种研究。

收稿日期20140704铁蛋白（Ferritin）广泛存在于生物体中，是由24个同源或异源亚基组成的450 kD复合体，由1个球形蛋白质外壳包裹，铁离子能够在这种复合体中浓缩，每个铁蛋白分子可以储藏0～4 500个可溶的、无毒的、可利用的铁离子，是迄今唯一能够调控铁离子从固相转到液相的蛋白[1-5]。铁蛋白的一个主要作用是储存铁离子，作为植物体光合作物和固氮的铁源；另一个主要作用是作为胁迫反应蛋白，促进过剩铁离子的储藏[6-8]。

铁是植物生长发育所必需的元素之一。植物缺铁叶绿素含量减少、叶片黄化，导致植物出现失绿症[9-10]；铁过量时会导致氧化胁迫，催化Fenton反应生成强氧化性的羟自由基，可导致细胞死亡。研究表明将豌豆铁蛋白基因转入水稻，转基因水稻的叶片与非转基因水稻相比对氧化胁迫的耐受能力有不同程度的增强[11]；将大豆铁蛋白基因转入烟草中，转基因烟草的生长量明显高于非转基因烟草株系，叶片中铁含量提高2～3倍，根中铁还原酶提高2倍以上，通过铁贮存能力的提高对除草剂造成的氧化胁迫抗性也有增强[12]；将紫花苜蓿铁蛋白基因转入烟草，获得的转基因烟草对除草剂百草枯引起的氧化胁迫抗性增强[13]。笔者利用农杆菌介导法将烟草铁蛋白基因转入粳稻中，以验证铁蛋白基因的功能，提高转基因粳稻的含铁量和转基因粳稻对盐胁迫和生物胁迫的抗性。

1材料与方法

1.1材料试验使用的粳稻品种为松粳6（Songjing6），烟草铁蛋白基因NtFer1（GenBank登录号：AB083924）由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室前期研究获得。 烟草铁蛋白NtFer1基因cDNA编码区全长756 bp，编码251氨基酸。

1.2方法

1.2.1载体构建与农杆菌培养。将获得的烟草铁蛋白基因NtFer1cDNA片段插入植物表达载体PBI121中替代GUS基因，启动子为CaMV35S，终止子为NOS，具有卡那霉素抗性，用冻融法将测序确认后的质粒导入农杆菌EHA105中。

将含有NtFer1载体的农杆菌涂布于LB固体培养基上（卡那霉素Km 50 mg/L、利福平Rif50 mg/L），27 ℃暗培养至菌斑清晰可见，挑取菌斑至LB培养液（Km 50 mg/L、Rif 50 mg/L），27 ℃、160 r/min，培养12～16 h，取500 μl上述培养液加入100 ml YEB液体培养基中待OD值在0.4～0.5时，侵染备用。

1.2.2粳稻转化。将松粳6的成熟种子脱去外壳，经75%乙醇 1 min、HgCl2和5%NaClO 20 min 消毒处理后无菌水冲洗干净，播入愈伤诱导培养基；14 d后剥离愈伤组织至愈伤继代培养基；10 d后转入预培养基，25 ℃暗培养4 d。

在超净工作台内将愈伤组织浸沒于农杆菌EHA105菌液中30 min，并每隔5 min晃动1次，取出愈伤组织吸干表面菌液于共培养基中，20 ℃暗培养3 d。经过筛选、分化和生根培养后，将获得的小苗移入气候箱营养液培养，收获种子。将转基因植株的T1代播种于MS培养基（Km 120 mg/L+ Fe2+300 umol/L），进一步研究生理特性等。

愈伤诱导：NMB+2 mg/L 2，4D+1 mg/L 6BA+1 g/L CH+600 mg/L L脯氨酸+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，pH 5.8；愈伤继代：NMB+1 mg/L 2，4D+0.5 mg/L 6BA+1 g/L CH+600 mg/L L脯氨酸+7.5 g/L琼脂+30 g/L 蔗糖，pH 5.8；预培养和共培养基：NMB+1 mg/L 2，4D+0.5 mg/L 6BA+1 g/L CH+600 mg/L L脯氨酸+120 mg/L AS+7.5 g/L琼脂+30 g/L 蔗糖，pH 5.8；筛选培养基1：NMB+1 mg/L 2，4D+0.5 mg/L 6BA+1 g/L CH+600 mg/L L脯氨酸+50 mg/L Km+500 mg/L Cef+7.5 g/L琼脂+3 0g/L 蔗糖，pH 5.8；筛选培养基2：NMB+1 mg/L 2，4D+0.5 mg/L 6BA+1 g/L CH+600 mg/L L脯氨酸+120 mg/L Km+300 mg/L Cef+7.5 g/L琼脂+30 g/L 蔗糖，pH 5.8；分化培养基：NMB+2 mg/L 6BA+1 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+1 g/L CH+600 mg/L L脯氨酸+120 mg/L Km+300 mg/L Cef+7 g/L琼脂+30 g/L 蔗糖，pH 5.6；生根培养基：1/2 MS+300 umol/L Fe2++0.2 mg/L NAA+120 mg/L Km+200 mg/L Cef+6 g/L 琼脂，pH 5.4；壮苗培养液1：MS+300 μmol/L Fe2+，pH 5.2；壮苗培养液2：Ms（N×1.5）+300 umol/L Fe2+，pH 5.2。

1.2.3T0代转基因粳稻分子检测。用试剂盒（原平皓，HF224）提取植株叶片总DNA。应用Primer Premier 5.0设计特异引物，NtFer1F（5CCA CTA TCC TTC GCA AGA CCC TTC C3）和NtFer1R（5CAT CGC AAG ACC GGC AAC AGG ATT C3），PCR反应体积20 μl，反应体系：模板0.5 μg，100 μmol/L引物各0.1 ul，10×Buffer（含Mg2+）2.0 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，5 μ/μl Taq 0.2 μl。反应条件：94 ℃2 min；94 ℃ 30 s，58.5 ℃ 30 s，72 ℃1 min，30个循环；72 ℃10 min。PCR产物经1%凝胶电泳分离成像。用DIG标记探针试剂盒（Roche）标记烟草铁蛋白基因NtFer1cDNA为探针，参照《分子克隆实验指南》方法进行Southern杂交。

用Trizol 法提取叶片总RNA，取30 μg总RNA 65 ℃水浴5 min，经1%甲醛变性胶电泳分离后转移至尼龙膜上Northern杂交，方法同Southern杂交。

1.2.4T1代转基因粳稻分子检测分析。用Trizol 法提取叶片和根部总RNA，参照试剂盒（Toyobo，Japan）说明书反转录成cDNA，以水稻Actin1基因为内参基因，外源基因特异引物为：NtFer1RTF（5AGG AGT TGA TGC TTG TAC CC3）和NtFer1RTR（5TTC TCA GCG TGC TCT CTT TC3），内参基因特异引物为：Actin1RTF（5ATC CTT GTA TGC TAG CGG TCG A3）和Actin1RTR（5ATC CAA CCG GAG GAT AGC ATG3）。擴增反应程序：95 ℃30 s，94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s、42个循环；熔解程序：94 ℃30 s，94～60 ℃台阶温度0.5 ℃保持1 min，94 ℃30 s。PCR检测同“1.2.3”。

1.2.5T1代转基因粳稻生理指标和叶绿素相对含量测定。经卡那霉素筛选在壮苗培养液1中生长60 d后测量植株上部鲜活叶片生理指标等。超氧化物歧化酶（SOD）活性用氮蓝四唑光化学还原法测定，过氧化物酶（POD）活性用愈创木酚法测定，过氧化氢酶（CAT）活性用紫外吸收法测定，丙二醛（MDA）含量用硫代巴比妥酸比色法测定，叶绿素相对含量利用SPAD502叶绿素仪（美能达，Japan）测定。

1.2.6T1代转基因粳稻Fe、Zn含量测定。根据Fe、Zn标准绘制标准曲线，湿式消解-原子吸收法（原子吸收分光光度计Z2000，Japan）测定叶片、根和糙米中Fe、Zn含量，重复3次，并计算样品加标回收率。

1.2.7T1代转基因粳稻稻瘟病抗性分析。 采集黑龙江省水稻主产区2010～2012年稻瘟病样本，分离62个单孢菌株高粱培养基培养，待生成大量分生孢子时将菌体悬浮液调成浓度2×105孢子/ml，每个菌株悬浮液取10 ml加入0.02%Tween20混匀，喷雾器均匀喷洒三叶一心幼苗，27 ℃，湿度90%，暗培养24 h，然后保持27 ℃，湿度90%，光照12 h/d，8、10和12 d调查叶瘟级别，叶瘟级别按国际水稻所稻瘟病抗性评价分级标准，根据病情指数公式计算病情指数[14-15]，计算公式如下：

病情指数=各级发病数×相应级数调查总数×最高级数×100

2结果与分析

2.1T0代转基因粳稻的分子检测为了从分子水平上证明烟草铁蛋白NtFer1基因cDNA是否整合到松粳6基因组中，对卡那霉素抗性植株进行PCR检测，结果表明卡那霉素抗性植株和阳性对照质粒均在750 bp处扩增出目的条带，而阴性对照的非转基因植株则无扩增条带出现（），初步证明外源基因整合到松粳6基因组中。从扩增出目的条带的转基因植株中选出3株长势较好的植株，进行Southern blot检测，转基因株系均能与探针杂交出条带（），进一步证明外源基因已整合到松粳6基因组中；分离总RNA进行Northern blot检测，分析表明在转基因植株中均检测到了相应的外源基因NtFer1表达的mRNA信号（），说明外源基因NtFer1已在转录水平表达。

注：1.Marker2000；2.阳性对照；3.非转基因对照；4～9.转基因植株。

T0代转基因植株PCR电泳图谱注：1.Marker2000；2.非转基因对照；3.阳性对照；4～6.转基因植株。

T0代转基因植株Southern杂交注：1.非转基因对照；2～4.转基因植株。

T0代转基因植株Northern杂交2.2T1代转基因粳稻分子检测T1代转基因粳稻Nt1、Nt2和Nt3 3个株系PCR检测，结果表明卡那霉素抗性植株和阳性对照质粒均在750 bp处扩增出目的条带，而非转基因对照植株则无扩增条带出现（），证明外源基因在转基因植株中稳定遗传；RTPCR检测表明，烟草铁蛋白NtFer1基因在Nt1、Nt2和Nt3 3个株系均有表达，且相同株系植株相对表达量无显著差异，而非转基因对照株系则无表达（）。

注：1.Marker2000；2.阳性对照；3.非转基因对照；4～6.转基因株系Nt1；7～9.转基因株系Nt2；10～12.转基因株系Nt3。

T1代转基因植株PCR电泳图谱注：CK.非转基因对照；Nt1、Nt2、Nt3.转基因株系。

RTPCR检测分析2.3T1代转基因粳稻生理指标和叶绿素相对含量分析SOD、CAT和POD在植物抗氧化胁迫中具有清除氧自由基和维持活性氧代谢平衡的功能，具有防止质膜过氧化的功能[16-19]。植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。在转基因株系中SOD活性、CAT活性显著高于非转基因对照22.9%、12.2%（、7），POD活性亦高于对照，但差异不显著。转基因株系MDA含量低于对照11.3%，且差异显著（）。上述差异表明，转入的外源铁蛋白基因NtFer1的表达能够提高转基因植株的抗氧化酶活性从而降低或抑制质膜过氧化水平。

注：CK.非转基因对照；Nt.转基因植株。

SOD活性 注：CK.非转基因对照；Nt.转基因植株。

CAT活性注：CK.非转基因对照；Nt.转基因植株。

MDA含量叶绿素是绿色植物进行光合作用的基础物质，是植物叶片的主要光合色素，研究表明[20-22]，叶片叶绿素含量与叶绿素仪所测定的SPAD值有良好的一致性。叶绿素相对含量转基因株系高于对照15.6%，且差异显著（）。

注：CK.非转基因对照；Nt.转基因植株。

叶绿素相对含量安徽农业科学2014年2.4T1代转基因粳稻Fe、Zn含量Fe、Zn标准曲线（0）、加标回收率和相对标准偏差（）符合试验要求。转基因植株根部Fe含量高于非转基因对照11.0%，叶片Fe含量高于对照32.6%，糙米Fe含量高于对照18.7%（1）。在转基因和非转基因对照植株根部FeZn含量呈显著正相关；而叶片和糙米中FeZn含量呈显著负相关，转基因植株的FeZn负相关系数低于对照（）。表明转入外源铁蛋白基因能够提高转基因植株组织和器官中Fe含量，同时降低FeZn拮抗程度，有利于营养元素的吸收与利用。

0Fe、Zn标准曲线回收率%

元素回收率RSDFe94.3～97.62.13Zn94.7～98.31.78

FeZn含量关系

株系根 FeZn含量关系叶片糙米CK0.243*-0.759*-0.81*Nt0.583*-0.338*-0.720*

注：a.根部；b.叶片；c.糙米；CK.非转基因对照；Nt.转基因植株。

1铁含量2.5稻瘟病抗性分析转基因植株的叶片在8、10和12 d稻瘟病病斑数量少于非轉基因对照，面积小于非转基因对照（2），叶瘟病情指数低于非转基因对照14.4%～15.9%且差异显著（3）。

注：CK.非转基因对照；Nt.转基因植株。

2叶片病情比较注：CK.非转基因对照；Nt.转基因植株。

3叶片病情指数3结论与讨论

通过对转基因植株和对照的比较分析，表明转入外源铁蛋白基因NtFer1能够提高粳稻的根、叶片和糙米中铁离子含量，同时提高了转基因植株SOD、CAT活性和叶绿素相对含量，MDA含量则相反，能够抑制稻瘟病病菌对叶片的伤害。

转入外源铁蛋白基因NtFer1通过提高铁蛋白的表达量，从而增加植物体内组织和器官贮藏铁离子的能力，增加了铁含量。过氧化氢酶（CAT）是以铁卟啉为辅基的结合酶；叶绿素的合成必须有铁的存在，铁是合成叶绿素中卟啉环的前体物质[23]。叶片铁含量的增加可以促进CAT和叶绿素的合成。Zn是SOD辅基的一种组成成分，在Fe过量的情况下FeZn呈负相关，而转基因植株的负相关系数低于对照，其Zn含量高于对照，故转基因植株SOD活性高于对照。SOD和CAT活性的提高，加速了植物体内O2-、H2O2、HO·的分解清除能力，降低质膜氧化作用，抑制MDA含量上升。铁蛋白作为一种胁迫反应蛋白，当叶片受到稻瘟病病菌侵染铁蛋白释放出贮藏的铁离子，产生Fenton反应生成具有强氧化力的羟自由基（·OH）以达到抑制病菌生长的目的[7，24]，有助于提高作物抗性从而增加产量。

在该试验中转基因植株和对照根部铁含量高于叶片的30～40倍，高于糙米的80～120倍，根部能够吸收和聚集大量的铁离子保障对其他组织和器官的供给，但叶片和糙米的铁含量远低于根部，其原因可能有三方面：一是粳稻对铁离子的转运能力不高造成；二是植株其他组织和器官自身调节和保护机制避免过量铁离子的富集对其毒害；三是受组织和器官中铁离子贮藏能力限制。虽然转入的外源铁蛋白基因NtFer1能够提高植株铁离子的贮藏能力，但这种提高程度依然受到植物体固有的机能制约和调控。

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