无患子粗提液抑菌杀菌作用的研究

朱朝阳 胡仁火 孔琼 任婷婷 周彩文

摘要 [目的]探究无患子粗提物的抑菌杀菌效果。[方法]酶解法提取无患子果皮中的皂苷，并测其皂苷含量。将皂苷粗提液稀释成3种浓度，用这3种浓度的粗提液分别对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和酵母菌进行抑菌试验，测定抑菌率;用无患子皂苷粗提液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌进行杀菌试验，测定杀菌率。[结果]随着无患子粗提液皂苷浓度的提高，其对金黄色葡萄球菌的抑菌率保持25%不变，对其他4种菌的抑菌率均有不同程度的提高，其中对酵母菌的抑菌率高达68.4%;111.9 mg/ml的无患子皂苷粗提液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌的杀菌率随着杀菌时间的延长均有不同程度的提高，其中对酵母菌的杀菌率最高，30 min内达100%。

关键词 无患子; 皂苷粗提液; 抑菌; 杀菌

中图分类号 S567  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2014）34-12081-02

Study on Bacteriostasis Activity and Disinfection Function of the Sapindus mukurossi Gaertn Crude Extract

ZHU Chaoyang， HU Renhuo*， KONG Qiong et al

（School of Nuclear Technology and Chemistry & Life Science， Hubei University of Science and Technology， Xianning， Hubei 437100）

Abstract [Objective] To study bacteriostasic activity and disinfection function of the Sapindus mukurossi Gaertn crude extract. [Method] Enzymatic hydrolysis was used to extract the saponin from the pericarp of the Sapindus mukurossi Gaertn， and then saponin content was tested. The saponin crude extract was diluted into three kinds of concentration which would be tested on Escherichia coli， Bacillus subtilis， Staphylococcus aureus， S.albus， Saccharomyces cerevisiae， then the inhibitory rate was determined; sterilization experiment was conducted by using Sapindus mukurossi Gaertns saponin extract on Escherichia coli， Bacillus subtilis， Saccharomyces cerevisiae. The sterilization rate was measured. [Result] With the saponin concentration increased， the inhibitory rate on Staphylococcus aureus remained 25% unchanged， while inhibition rate on the other four kinds of bacteria increased in different degree， including inhibition rate on Saccharomyces cerevisiae was as high as 68.4; 111.9 mg/ml of Sapindus mukurossi Gaertn saponin crude extracts sterilization rate on Escherichia coli， Bacillus bacillus， Saccharomyces cerevisiae have different degrees of improvement with the sterilization time prolong， among them the highest sterilition rate of Saccharomyces cerevisiae reached 100% in 30 min .

Key words Sapindus mukurossi Gaertn; Saponin crude extract; Bacteriostasis activity; Disinfection function

無患子是无患子科无患子属的一种落叶乔木，学名无患子（Sapindus Mukurossi Gaertn），俗称油患子、洗手果等。主产于东南亚各国，我国的长江流域、南部各省及海南岛均有栽培。无患子的果皮、种子、根、皮、叶均有药用价值。目前对无患子的研究主要集中在化学成分的分析及有效成分皂苷的提取与分离[1]，也有关于无患子粗提物杀虫活性的报道[2]。无患子对真菌的作用偶有报道[3]，无患子皂苷抑菌杀菌活性研究鲜见报道。该研究选取了5种常见菌作为供试菌种进行抑菌杀菌试验，研究无患子皂苷的抑菌杀菌作用，以期为植物源杀菌剂的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 无患子果。在湖北科技学院校园内采摘，烘干去核备用。

1.1.2 供试菌种。大肠杆菌（Escherichia coli）;枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）;白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）;酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。菌种由华中农业大学发酵工程室提供。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 试验仪器。DH5000AB电热恒温培养箱（天津市泰斯仪器有限公司），SWCJID超净工作台（苏州净化设备有限公司），YX280A手提式不锈钢蒸汽消毒器（上海三申医疗器械有限公司生产），IU1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），KA0018465移液器（DragonLAB），84Ⅱ磁力搅拌器（山东鄄城永兴仪器厂），ASW20501U实验室超纯水系统（艾科浦），JA5003电子天平，SHH.Wo1.600电热恒温水槽。

1.2.2 试验试剂。5%NaOH溶液，5%HCl溶液，pH试纸，纤维素酶（上海如吉生物科技发展有限公司），冰醋酸（分析纯，天津博迪化工有限公司），高氯酸（分析纯，天津市鑫源化工有限公司），甲醇（科密欧，天津市科密欧化学试剂有限公司），香草醛（Vanillin，上海源叶生物科技有限公司），齐墩果酸（上海源叶生物科技有限公司）。牛肉膏蛋白胨培养基，PDA培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 无患子皂苷粗提液制备及皂苷浓度测定。

1.3.1.1 无患子皂苷粗提液制备。在70 ℃条件下干燥无患子果，去核，粉粹果皮。称取200 g粉末，加10倍水、0.015%纤维素酶，在pH=4、50 ℃条件下酶解2 h，期间每隔20 min搅拌一次。酶解液减压抽滤，90 ℃加热2 min，再抽滤得滤液备用[4]。

1.3.1.2 皂苷浓度测定。配制0.000 2 g/ml齐墩果酸-甲醇对照液10 ml，备用;配制0.05 g/ml香草醛-冰醋酸液10 ml，备用。分别用微量加样器取对照液20、50、80、130、150 μl，先后依次加入5%香草醛-冰醋酸液0.4 ml、高氯酸1.4 ml，充分摇匀后于70 ℃水浴加热20 min，取出后立即冰水冷却2 min，加入10 ml冰醋酸，在478 nm處测吸光度，以不加对照液为空白组[5]。分析得出标准曲线后，取80 μl无患子粗提液按上述过程操作测得其吸光度，再计算无患子粗提液皂苷浓度[6]。

1.3.2 菌悬液的配制。将上述5种菌，分别用接种环挑取少许菌体于装有无菌生理盐水的试管中，振荡均匀，制成菌悬液，用血球计数板计数，用无菌生理盐水稀释至106 cfu/ml，备用[7]。

1.3.3 无患子皂苷粗提物的抑菌试验。将无患子皂苷粗提物稀释成3个浓度梯度，即C1=111.9 mg/ml、C2=74.6 mg/ml、C3=37.3 mg/ml，以无菌水为空白对照，共4个处理。用滤纸片扩散法[7]进行抑菌试验，即无菌条件下用微量加样器吸取100 μl菌液加入平板固体培养基中，用涂布器涂布均匀，一共涂布4个平板（平板直径9 cm），1号平板贴3片浸有C3皂苷提取液的无菌滤纸片，2号平板贴3片浸有C2皂苷提取液的无菌滤纸片，3号平板贴3片浸有C1皂苷提取液的无菌滤纸片，4号平板贴3片浸有无菌水的无菌滤纸片作对照（滤纸片直径均为6 mm）;5种菌的操作与上述相同。将涂布好并贴有滤纸片的细菌平板在37 ℃条件下倒置培养24 h，将涂布好并贴有滤纸片的酵母菌平板在28 ℃条件下倒置培养48 h。测抑菌圈大小，计算抑菌率。抑菌率 =（试验抑菌圈直径-对照抑菌圈直径）/试验抑菌圈直径×100%。

1.3.4 无患子皂苷粗提物的杀菌试验。

用C1的无患子皂苷提取液对酵母菌、枯草杆菌、大肠杆菌3种菌进行杀菌试验。无菌条件下，在1号和2号的洁净离心管中加1 ml无患子皂苷提取液、3号加1 ml无菌水。用移液器取20 μl搅拌均匀的大肠杆菌菌液滴在1号离心管中，摇匀，30 min后取20 μl液体均匀涂布在牛肉膏蛋白胨固体培养基上;用移液器吸取20 μl大肠杆菌菌液滴在2号离心管中，摇匀，15 min

后取20 μl液体均匀涂布在牛肉膏蛋白胨固体培养基上;用

移液器吸取20 μl菌液滴在3号离心管中，摇匀后取20 μl均匀涂布在培养基上。每一时间梯度3个重复。同样，枯草杆菌菌、酵母菌均按上述操作试验，酵母菌涂布在马铃薯培养基上。大肠杆菌、枯草杆菌在37 ℃条件下培养24 h，酵母菌在28 ℃条件下培养48 h。统计培养好的平板菌落数，计算杀菌率。

杀菌率=（对照菌落数-处理菌落数）/对照菌落数×100%。

2 结果与分析

2.1 无患子皂苷粗提液浓度测定结果 由图1可知，皂苷溶液的标准曲线回归方程式为 y=0.003 1x+0.010 6（R2=0.968 2），测得无患子皂苷粗提物的吸光度OD=3.48，无患子皂苷粗体液浓度C=111.9 mg/ml。

图1 无患子皂苷粗提液浓度测定

2.2 无患子皂苷粗提液对5种菌的抑制结果

从表1可知，皂苷提取液对5种试验菌均有抑制作用，随着皂苷浓度升高，除金黄色葡萄球菌外对其他4种菌的抑制作用均有不同程度的提高;皂苷粗提液对酵母菌的抑制效果最好，抑菌率可达68.4%，与对照组相比抑菌圈大小达到了极显著水平，这与Tamura的研究结果[8]相似，皂苷粗提液对金黄色葡萄球菌的抑制效果最弱。不同的菌对皂苷的敏感程度存在显著差异。

表1 无患子粗提液对五种菌的抑菌作用

皂苷粗提液

mg/ml

枯草芽孢杆菌抑菌圈∥mm抑菌率∥%

大肠杆菌抑菌圈∥mm抑菌率∥%

金黄色葡萄球菌抑菌圈∥mm抑菌率∥%

白色葡萄球菌抑菌圈∥mm抑菌率∥%

酵母菌抑菌圈∥mm抑菌率∥%

37.311.0b 45.510.4b42.38a258.6b 30.216.6bB63.9

74.614.0b 57.110.5b42.98a259.0b33.318.0bB66.7

111.914.2b57.711.0b45.58a2510.0b40.019.0bB68.4

06.0a06.0a0 6a06.0a0 6.0aA0

注：抑菌圈大小均为3个数据的平均值。表中小字母代表0.05的显著水平，大字母代表0.01的显著水平。

2.3 无患子皂苷粗提液对枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌的杀菌作用

由表2可知，杀菌时间在15 min时，111.9 mg/ml皂苷粗提液对大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌的杀菌率分别为35.60%、46.72%、98.59%;30 min时，皂苷粗提液对大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌的杀菌率分别为46.56%、52.11%、100.00%。15 min和30 min处理结果与对照组结果存在极显著差异，而15 min和30 min处理结果间无显著差异;无患子皂苷对酵母菌的杀菌作用与对大肠杆菌和枯草杆菌的杀菌作用存在极显著差异。无患子皂苷对酵母菌的杀菌作用强于对其他2种细菌的杀菌作用，其结果与抑菌试验的一致。用111.9 mg/ml皂苷粗提液对白葡萄球菌、金黄色葡萄球菌进行杀菌试验，杀菌率均低于28%，故没有列入表中。

表2 无患子粗提液对3种菌的杀菌作用

杀菌时间

min大肠杆菌杀

菌率∥%枯草杆菌杀

菌率∥%  酵母菌杀

菌率∥%

1535.6046.7298.59

3046.5652.11100.00

对照000

3  结论与讨论

试验结果表明无患子皂苷对大肠杆菌、金黄色葡萄球