玉米种质材料遗传多样性的ISSR分析

祁丽婷 李中青 赵晋峰 李齐霞 李颜芳 王瑞 孙万荣 王敏 王枫叶

摘要 [目的] 明确山西主要玉米品系的主要遗传多样性特点。 [方法]利用ISSR分子标记技术，对供试的玉米种质资源进行遗传多样性分析。[结果]用筛选出的9个多态性高、重复性好的引物对供试种质材料进行扩增，共扩增出清晰条带74条，多态性条带56条，多态性条带比率为75.7%。应用DPS软件对试验结果进行聚类分析，构建聚类分析树状图，在遗传相似系数为0.55处，将供试种质材料分为5个类群。[结论] 为今后山西玉米育种与杂交亲本的选择提供理论依据。

关键词 ISSR;玉米;遗传多样性;聚类分析

中图分类号 S188  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2014）34-12046-02

Genetic Diversity of Maize Accessions Using Intersimple Sequence Repeat （ISSR） Markers

QI Liting，LI Zhongqing， ZHAO Jinfeng et al

（Millet Research Institute， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Changzhi， Shanxi 046011）

Abstract [Objective] The aim was to clear main genetic diversity characteristics of main corn strain  in Shanxi. [Method]Using ISSR molecular markers to analyze the genetic diversity of maize germplasm resources. [Result] Nine primer of high polymorphism and good repeatability were used to amplify the germplasm material on the test. 74 bands were amplified， including 56 polymorphism bands. The percentage of polymorphism bands was 75.7%. Application of DPS software clustering analysis was carried out on the experimental results， and built the cluster analysis tree. The test germplasm materials were divided into five groups at the genetic similarity coefficient of 0.55. [Conclusion] The study provided theoretical reference for the selection of hybrid parent and maize breeding in the future.

Key words ISSR;Maize;Genetic diversity;Cluster analysis

玉米是现代食品、饲料、医药及化工的重要原料作物，在国民经济中占有非常重要的地位。山西省玉米种植面积达160万hm2，已取代小麦成为山西省的第一大粮食作物。生态适应性分析表明，玉米是山西最适宜种植的作物，在山西具有明显的区域优势。近年来，由于分子生物学的飞速发展，不仅可以在分子水平上了解育种材料的遗传变异信息，有针对性地选择杂交亲本，在后代中获得优良变异，从而培育出优良品种，同时了解这些品种的遗传多样性，对于指导亲本选配和培育优质高产品种具有重要意义。

笔者拟采用最为广泛应用的ISSR分子标记技术[1]，对山西生产区域内主要自交系进行遗传多样性分析，明确山西主要玉米品系的主要遗传多样性特点，为今后山西玉米育种与杂交亲本的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试材料均由山西省农科院谷子研究所早熟课题组提供（表1）。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米总DNA提取。 将供试材料播种在装有沙子的营养钵中，在温室（25 ℃左右）内培养。每个材料种10株左右，待幼苗长至3～4叶，叶片长度为10 cm左右时剪去叶片，采用通用的CTAB方法提取总DNA，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 反应程序。

①反应体系（20 μl）：2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μl，10×buffer 2.0 μl，2 μmol/L 引物2 μl，5 U/μl Taq酶 0.2 μl，DNA 模板 3.0 μl，ddH2O 11.2 μl，另加mineral oil密封，在PCR板中进行。

②PCR 反应程序：94 ℃变性7 min;94 ℃变性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，45 个循环;72 ℃后延伸7 min，4 ℃保存。

③电泳检测：扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。 PCR产物中加入 6×loading buffer 4 μl，混勻后点样于孔中，接通电源后，电泳仪电压调至120 V进行电泳。

④电泳结束后，将电泳结果在紫外凝胶成像系统上观察、照相、保存。

表1 供试试验材料

编号自交系名称编号自交系名称编号自交系名称

1C19015C20629Mo17

2C19116C20930郑58

3C19217C21231H51

4C19318C21332H391

5C19419C21433先玉128M

6C19520C21634冀海57

7C19621C21735478

8C19822C21936M2

9C19923C22137K12

10C20024C22038先玉508M

11C20225C22239先父

12C20326C223409903

13C20427C224

14C20528昌7-2

1.3  數据处理与分析

人工读取条带，采用1/0记录方式。相同迁移率位置上有条带的记为1，无条带的记为0，建立数据矩阵。用DPS 6.05分析软件中UPGMA对其进行聚类分析并绘制亲缘关系树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 ISSR扩增多态性

从52对引物中筛选出9条条带清晰、稳定且无拖尾的引物（表2）。用筛选出的引物对供试自交系材料进行扩增（图1、2），共扩增出清晰条带74条，多态性条带56条，多态性条带比率为75.7%，表明供试自交系材料扩增出的片段具有较高的多态性。

表2 ISSR引物序列及其扩增产物的多态性比较

引物名称引物序列总带数多态条带多态性比例∥%

ISSR 8075′AGAGAGAGAGAGAGAGT3′9.07.077.78

ISSR 8085′AGAGAGAGAGAGAGAGC3′8.06.075.00

ISSR 8105′GAGAGAGAGAGAGAGAT3′10.09.090.00

ISSR 8115′GAGAGAGAGAGAGAGAC3′10.08.080.00

ISSR 8155′CTCTCTCTCTCTCTCTG3′7.04.057.14

ISSR 8175′CACACACACACACACAA3′8.06.075.00

ISSR 8185′CACACACACACACACAG3′7.05.071.43

DISSR 8255′ACACACACACACACACT3′9.05.055.56

ISSR 8275′ACACACACACACACACG3′8.06.075.00

ISSR 8645′ATGATGATGATGATGATG3′7.05.071.43

总数83.061.0

平均8.36.172.83

图1  P811对部分玉米自交系ISSR的扩增图谱

2.2 聚类分析

将构建好的ISSR数据输入DPS 6.50中，应用类平均法（UPGMA）获得聚类图（图3）。在遗传相似系数为0.55处，40份玉米自交系可以分为5个类群。第Ⅰ类包括C190、C192、C200、C191、C193、C194、H391、C203、C205、昌72、9903共11个株系;第Ⅱ类包括C195、C204、郑58、478、C206、C209、C213、C214、C216、C217、M2、先玉508M、先玉128M、C196、C198、Mo17、H51、先父、K12共19个株系;第Ⅲ类包括C212、C222、C223、C224、C219、C221、C220共7个株系;第Ⅳ类包括C199一个株系;第Ⅵ类包括C202、冀海57 2个株系。

图2 P864对部分玉米自交系ISSR的扩增图谱

图3 玉米自交系的ISSR亲缘关系聚类图谱

3 讨论

分子生物学的发展使得种质资源之间的遗传性以及亲缘关系得到了明确。特别是ISSR标记技术，凭借其较好的稳定性、试验的可重复性以及操作简单、快速、高效等优点[2-4]，广泛应用于基因定位、品种鉴定、遗传作图、系统发育[5]、进化及分子生态学等研究中，特别是应用于遗传多样性和亲缘关系研究中[6-7]。

从该试验看，ISSR分子标记是一种较为理想的标记方法，在一定程度上可以确定各个种质材料之间的遗传关系。但由于目前的种质材料繁多，特别是经过多年的种植和应用，难免会有基因漂移、突变等因素，所以笔者只能确定该试验材料之间的亲缘关系。该试验却与公认的类群分类有出入。如郑58属于瑞种质，Mo17属于兰卡斯特种质，却被分在了同一个类群。这也与王寒玉等得出的试验结论相同[8-9]。另外，读取条带时为人工读带，可能会存在不同的人读取的条带会有所差异，以及聚类分析软件的不相同，这也是试验结果可能不一致的原因。所以划分的种群是相对的。

4 结论

该研究表明，利用ISSR分子标记技术对玉米进行遗传多样性分析是可行的。但此方面研究还应与实际育种工作相结合，使得育种工作者可以充分了解材料的育种变异信息，有针对性地选择亲本，有效提高育种效率[10]，培育优质的新品种，才能更好地为育种工作提供理论依据。

参考文献

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