宫颈癌筛查方法的研究进展

李娟 田亚平

【摘 要】宫颈癌筛查对降低宫颈癌的发生率和死亡率至关重要。目前实验室方法已不局限于细胞学方法，还包括了高危型人乳头瘤病毒检测、阴道镜检测等，随着将生物技术的发展，也产生了一些生物标志物，可能作为细胞学、高危型人乳头瘤病毒检测筛查宫颈癌的补充。本文对目前这些方法在宫颈癌筛查中的应用情况和各自的局限性作一综述。

【中图分类号】R737 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）04-2065-02

子宫颈癌是全球女性第三大最常见的癌症，次于乳腺癌和结肠癌。在亚洲，子宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二种常见恶性肿瘤。在2012年，美国约有新发病例数12，200，死亡4200[1]。在美国，宫颈癌的发病率在降低，但是在西班牙、拉丁美洲和亚洲女性仍发病率很高。2004年，我国宫颈癌新增病例数13.15万，死亡5.3万，近年来我国局部地区的发病率和死亡率有增长趋势， 部分地区患病呈现“年轻化”趋势，给社会带来了巨大的健康负担和经济负担。

高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus infection，HPV）的持续感染被认为是宫颈癌发生的主要因素。HPV病毒可以整合到宿主的染色体，编码E6和E7蛋白，通过抑制P53和Rb蛋白的作用参与宫颈癌的形成[2]。癌症可以通过预防达到有效控制，一级预防包括避免已知的危险因素，宫颈癌癌症是由HPV感染引起，接种高危型HPV疫苗可以降低宫颈癌的发病率，如果条件许可，男性也可以包括在内。二级预防包括通过早期筛查及早发现和治疗[3]。目前宫颈癌的实验室方法有很多， 本文对目前这些方法在宫颈癌筛查中的应用情况和各自的局限性作一综述。

子宫颈癌二级预防的目的是通过早期筛查及早检测和治疗。宫颈癌筛选常用的方法包括细胞学方法、HPV检测法、阴道镜检查还有其他检查方法。

1 细胞学方法

宫颈细胞学检查一直是自1940年以来宫颈癌筛查的标准方法，但该技术在早期不同研究中灵敏度和特异性各异。

1.1传统巴氏细胞涂片 PAP

宫颈细胞学检查最早由Papanicolaou70年前引入的，称为PAP test，可以检测宫颈癌或CIN的细胞变化。检查结果异常的妇女再经阴道镜检查。常规细胞学检查 宫颈癌（巴氏试验）是一个 有史以来最成功的宫颈癌筛查试验。尽管Pap smear已经大量降低了宫颈癌的发生率，但是该法并不完善，主要是由于受到取材、制片、染色及阅片技术等主观因素的影响，假阴性率高、敏感性低，易造成漏诊等现象[4]。1995年的一个Meta分析表明传统的巴氏涂片的平均灵敏度为58%（范围11-99%），特异度为69%（14-97%）[5]。

1.2液基细胞学

液基细胞学（LBC）在20世纪90年代被引入，改善了传统巴氏涂片采样、制片、阅片等问题，具有较高的特异性和阳性预测值。液基细胞学的优点是：提高了样本的收集率、降低了不合格涂片的数量、可以自动阅片等，不仅可以做细胞病理学检查还可以用于后续液基细胞学HPV DNA检测。液基细胞学检查已被广泛用于宫颈癌的筛查，但是关于液基细胞学的灵敏度和特异度也存在一定异议。在一个意大利随机对照研究显示，LBC与传统巴氏涂片相比，对CIN1有较高的灵敏度，对CIN2的灵敏度类似或者降低，但液基细胞学检查的阳性预测值较低。然而在荷兰的一项大型随机试验的研究结果并没有显示出这两种方法在灵敏度或阳性预测值之间有显著差异[6]。但在发展中国家，存在从基础设施落后、训练有素的细胞学技师较少等问题，且价格也比传统的巴氏涂片较昂贵，由此限制了液基细胞学的广泛应用。

2 肉眼观察法VIA

VIA是检测浸润前宫颈癌的方法， 由受过培训的医务人员简单地完成。该过程包括用3-5%醋酸浸泡子宫颈约1分钟然后用肉眼观查颜色变化。一个Meta分析表明，VIA有79-82%的灵敏度，91-92%的特异度及8-9%的假阳性率[7]。适当的情况下（非妊娠妇女异常病灶<子宫颈的75%，损伤程度小于2 mm的冷冻探针，或不进入宫颈管），可以在一次检测中立即用冰冻疗法对患者进行治疗[3]。一个印度的大型群随机试验研究显示，经过一轮VIA筛查，宫颈癌的发病率（危险比0.75，95%CI为0.55-0.95）和死亡率（0.65，0.47-0.89）降低了[8]。在一个对巴氏涂片、VIA和HPV DNA检测方法的对比研究中发现，VIA是35-55岁间隔5年并立即治疗的妇女是最便宜和拯救患者数量最多的方法[9]。2002年，乔友林等在中国山西省同时采用六种筛查方法对1997名妇女的筛查中，发现VIA法虽然灵敏度与特异度较HPV DNA检测法、Thinprep法低，但与阴道镜相比并无显著性差异，可至少检测出2/3以上的宫颈高度病变，是一种简便、低廉的筛查宫颈癌及癌前病变的检测手段。进行筛这种技术的局限性在于，在一些妇女的鳞柱相接处不能充分观察到，特别是在更年期。在一些资源有限，特别是细胞学筛查率较低的地方非常有用。

3 HPV testing

高危型HPV的持续感染是宫颈癌发生的必要条件，hpv testing 可以用来筛查宫颈疾病（10）。最常用的是信号放大（杂交捕获）和靶标扩增（PCR）两种方法。与靶标扩增法相比，雜交捕获通常灵敏度较低，但特异度更高。HPV DNA检测是一个主要筛选试验，如用于细胞学异常后分类或与细胞学方法协同测试。HPV DNA检测有66-100%的敏感度和 1-96%的特异度。一个2011年的Meta研究报道，HPV检测虽然敏感度很高，但是与比细胞学检测相比对CIN2-3检测的特异度低[11]。一项对欧洲四个随机对照的随访研究比较了人乳头瘤病毒（HPV）筛查和细胞学筛查对预防浸润性宫颈癌的相对效果， HPV筛查与细胞学检查相比，对浸润性宫颈癌提供了更多的60-70%的保护。该规模的随机临床试验支持，应该从30开始HPV筛查年，并可延长至少5年筛查间隔[12]。一个在印度农村地区大型群随机试验，通过衡量单轮HPV DNA检测、细胞学筛查、VIA检测和不筛查对宫颈癌发病率和死亡率的影响，发现单一细胞学筛查和VIA 筛查与对照组相比对宫颈癌的发病人数和死亡人数之间无显著差异，而单一HPV检测与晚期宫颈癌新发病例和死亡人数显著下降有关[13]。在一个荷兰的成本效益研究发现， HPV DNA与细胞学协同检测的方法是目前从社会角度看性价比最高的筛查策略。研究者发现增大筛查的时间间隔，将首要做细胞学检测改为HPV检测，可以提高该国家宫颈筛查的有效性[14]。

但是，HPV DNA检测的成本对于发展中国家仍较高；现在也在研究便宜的HPV DNA检测方法。在中国农村的一项研究结果表明，一种低成本的HPV 检测方法（care HPV； QIAGEN， Gaithersburg， MD， USA）达到了与杂交捕获2（QIAGEN Inc， Gaithersburg， MD， USA）相似的准确度，敏感性 90.0%，特异度为84.2%[15]。

然而，多数HPV感染是短暂的，一个HPV阳性的妇女有较低的风险进展为癌前病变和癌症。识别宫颈癌癌前病变并进行治疗是十分重要的，但对暂时有HPV病毒感染进行反复转诊则是不必要的。如何更好地管理HPV阳性患者目前还不清楚。各国在做HPV筛查时需要更多考虑后勤方面的问题，如建立HPV筛查试验的类型，确定适当的筛选年龄和时间间隔，确定HPV阳性妇女的管理政策等。在HPV检测阳性的情况下，需要制定一定的策略决定哪些HPV病毒阳性患者需要转诊进行阴道镜检查。在决定哪些策略用于HPV阳性患者分流時有几个因素需要考虑。

首先，分流试验阳性表示 HPV阳性的有多少比例需要转诊进行阴道镜检查。二，基于分流后检测结果的阳性结果和阴性结果导致的绝对风险和个体风险的不同管理的是否得到了保证。最后，结果为阴性的个体纵向风险显示其安全的测试时间间隔[16]。第一个纵向研究数据发表在柳叶刀肿瘤学上面， Francesca Carozzi及其同事将P16-INK4A细胞学检查作为HPV阳性的分流实验的新技术进行宫颈癌筛查。他们的结论是，p16基因的过度表达是CIN2（或发展为）或更坏阶段的HPV阳性的妇女的一个标志物，尤其是在年龄35-60岁之间的。可以对HPV阳性妇女进行p16基因检测，HPV阳性且P16阳性的妇女需立即用阴道镜检查，若检测结果为阴性，可每年随访。应避免对HPV阳性和p16蛋白阴性的妇女立即进行阴道镜检查， p16阴性的妇女有2-3年的安全时间间隔[17]。

作为二级预防，在一些只具备有基础资源的国家，30岁至45岁之间的女性应该每隔5-10年进行一次VIA筛查。在资源有限的地区，VIA应该从30-45岁开始，每5年筛查一次，对于阳性结果的应该同时进行传统巴氏涂片筛查，或5-10年进行一次低成本的HPV检测。 在资源丰富的地区，液基细胞学检查可以替代传统的巴氏涂片与HPV协同检测。在拥有最大化资源的国家，液基细胞学与HPV筛查可以每5年进行一次。

4 阴道镜检查

阴道镜引导下活检和锥形活检组织学检查宫颈组织，放大10-40观察宫颈和阴道上皮部位，可观察到肉眼看不到的微小病变，还可在阴道镜定位下作活组织检查，是临床上辅助诊断宫颈癌及癌前病变的重要方法。研究表明，阴道镜诊断准确性高，但是由于操作不方便和侵入性，将它们用于宫颈癌的大规模筛查不太现实。国际妇产科联合会主要采用阴道镜、活组织检查、宫颈锥切术、膀胱镜检查、直肠乙状结肠镜检查等方法用于宫颈癌分期。

5 其他检查

预计在不久的将来高危型人乳头状瘤病毒（HR-HPV）检测将成为在一些国家宫颈癌筛查的主要方法。然而，只有一小部分HR-HPV阳性女性有临床相关的病变。因此，目前迫切需要额外的生物标记物，可以与细胞检查一起同时检测这些病变。发展非侵入性的具有高灵敏度的分子生物标志物，可以补充和完善宫颈癌的筛查策略[18]。

5.1 p16 INK4a

P16-INK4a，是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，其表达受到RB1基因产物的负调节。通常情况下，P16-INK4a蛋白在健康细胞中表达非常低，而在宫颈癌细胞系过表达，这是由于RB功能受到高危型HPV E7蛋白的抑制[18]。 因此，通过免疫染色或酶联免疫吸附测定（ELISA）的p16的过度表达，不仅可以认为是受到HPV病毒感染的标志物，也是病毒性癌基因表达激活和病毒诱导的细胞周期失调的标志物，这使得其可以成为对HPV-DNA阳性的妇女分流的候选标志物[19]。Carozzi F 等对24 661 例HPV阳性的妇女的一个多中心随机对照研究中，发现与常规细胞学检查相比HPV检测与P16-INK4A分流的策略显著增加了筛查的敏感性[19]。

5.2 methylation status of the promoter regions of CADM1 and MAL

持续感染高危型HPV感染导致子宫颈癌发生，但是从癌前病变发展到浸润癌的过程也需要遗传和表观遗传的改变。DNA甲基化是宫颈癌发生的一种早期的和常见的分子改变[20]。在宫颈癌形成过程就很易见到HPV长控制区（LCR） 和 L1 基因的甲基化。启动子甲基化诱导的CADM1 （细胞粘附因子）、MAL（淋巴细胞成熟相关蛋白）、microRNA-124-2 的基因沉默在也宫颈癌的形成过程中发挥作用[21]。在严重的宫颈疾病中可以检测到这些基因存在高度甲基化[22]。Hesselink AT开发了一个的甲基化标记模型（CADM1-m18 和 MAL-m1），在高危型HPV阳性妇女中，与单独细胞学检查或细胞学加高危型HPV（HPV16/18）基因分型一样的区分CIN3（+）[23]。这为宫颈癌筛查提供了一个潜在的客观的、非形态学的分子生物学检测方法。

5.3 循环RNA

循环RNA最早在鼻咽癌和黑色素瘤患者的血浆和血清中检测到[24]，随后也在其他癌症患者血液中检测到。与循环DNA相比，循环RNA的灵敏度和组织特异性更高[25]，在一些疾病中，发现循环RNA与疾病的预后相关[26]。血液中可检测的、稳定RNA的出现使得循环RNA可以成为一种非侵入性的的标志物，用于疾病的早期诊断、预后和监测治疗效果。Xin Zhang等用R T-qPCR 方法检测了109例宫颈癌患者、 138例 CIN患者 和80明健康对照血清中循环Bmi-1 mRNA 水平，发现宫颈癌组的Bmi-1 mRNA 水平显著高于疾病对照组和健康对照组，Bmi-1 mRNA与SCC和CA125相比具有更高的诊断能力，且他们发现Bmi-1 mRNA 水平升高与宫颈癌的总生存率和无进展生存率降低相关，他们认为Bmi-1 mRNA有可能成为宫颈癌诊断和预后的分子标志物[18]。

5.4 循環miRNA

MiRNA，是一类小分子RNA，已发现其参与调节细胞增殖、细胞循环、分化、凋亡等生理过程。研究发现miRNA在很多疾病存在异常表达，如糖尿病、心脑血管疾病和癌症等[27]。已在很多研究中观察到宫颈癌的miRNA表达谱相对于正常对照发生了改变。如与正常对照相比宫颈癌组织中miR-143和 miR-145的表达降低[28]，而Wang等进一步发现miR-143和 miR-145表达水平在宫颈癌组织和HPV感染的肿瘤前期病变组织降低，表明了miR-143和 miR-145水平早于癌症的发生[29]。Zhu YK等发现由HPV直接或间接导致的致癌蛋白E6、E7和E5使大量miRNA如miR-34a、miR-218、miR-29A和miR-146a等表达失调，继而导致宫颈癌的发生和发展[30]。不仅在宫颈癌组织或细胞中可以观察到miRNA表达谱发生变化，在血液中，Yu J等用实时荧光定量PCR方法检测了90例宫颈癌患者和50例健康对照miR-218的表达水平，发现大对数宫颈癌患者中miR-218的水平下降且与肿瘤的浸润相关[31]。目前已有研究认为血清或血浆肿瘤衍生的miRNA是可以成为潜在的血液标志物，用于人类癌症的检测，尤其是在早期阶段[32]。Zhao S等发现宫颈癌患者血清miR-20a和miR-203水平显著高于健康对照，且与淋巴结转移相关，预示它们有可能成为宫颈癌患者淋巴结是否转移的标志物[33]。目前，宫颈癌相关的miRNA仍处于起步阶段，需进一步研究已知的或新的miRNA在宫颈癌发生机制中的作用，并探讨它们在宫颈癌诊断和预后方面的临床价值。

虽然这些生物标志物非常有前途，可能用于宫颈癌的辅助诊断，但尚无研究评估这些生物标志物进行分类或预测的结果的准确性。还需要更多的临床试验，以确定这些有潜在作用的细胞学生物标志物的真正的临床价值。

总之，目前宫颈癌的筛査方法中，细胞学检查仍是我国宫颈癌筛查的主要方法，考虑到我国目前尚无宫颈癌疫苗，宫颈癌筛查仍面临巨大压力。急需建立完善的国家宫颈癌筛查策略，补充并完善其他辅助诊断方法，提高宫颈癌的总体筛查效率从而降低宫颈癌的发生率和死亡率。

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