斑马鱼常见病原菌及其质量控制的研究进展

杨迟　林金杏　胡建华

摘要近年来，随着现代生命科技的不断深入研究，斑马鱼因其独特的生物学特性已成为一种重要的脊椎动物模式生物，是国际上应用最为广泛的实验鱼类。但是目前在我国，对实验用鱼仍缺乏标准化的质量控制及监督管理制度。阐述了斑马鱼的主要细菌性疾病及常见病原菌的质量控制，以期为实验用鱼的标准化制定及应用提供一定的参考。

关键词斑马鱼；病原菌；质量控制；标准化

中图分类号S965.819文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01068-03

基金项目国家科技支撑计划项目（2013BAK11B02）。

作者简介杨迟（1990- ），女，贵州贵阳人，硕士研究生，研究方向：动物微生物质量控制。*通讯作者，胡建华，研究员，从事实验动物质量监控。*通讯作者，林金杏，博士，从事实验用鱼类生理功能及质量控制。

斑马鱼作为一种国际上应用最广泛的实验鱼类，已成为一种重要的模式生物，被广泛用于发育生物学、遗传学、毒理学等领域的研究[1-3]，但我国对其标准化的研究还相对落后[4-5]。随着对实验用斑马鱼研究的不断深入，对其标准化的研究制定也显得越来越重要，而微生物的质量控制则是该标准体系不可或缺的重要一环。笔者分析并整理了由常见病原菌感染引起的斑马鱼疾病及其相关研究等数据资料，对实验用斑马鱼的微生物质量控制进行了阐述，旨在为今后实验用鱼的标准化制定及应用提供一定的参考依据。

1实验用斑马鱼

1.1斑马鱼的生物学特性斑马鱼（Danio rerio，Zebrafish）又名蓝条鱼、花条鱼等，隶属脊椎动物门、硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、短担尼鱼属，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼。斑马鱼整体上呈纺锤型，身体细长，一般成鱼体长3～5 cm，约3～4月龄即可达到性成熟，每隔1周可进行1次交配，产卵数量在几百粒左右[6-8]。雌雄鉴别比较容易，雄鱼为深蓝间柠檬色条纹，且鱼体修长，鳍大；雌鱼为蓝色间银灰色条纹，鱼体比较肥大，体色偏淡，各鳍均比雄鱼短小，怀卵期鱼腹膨大明显[9]。

1.2斑马鱼的实验动物化依据实验动物是指经人工饲养对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确且来源清楚，用于科学研究、教学、生产、检定以及其他科学实验的动物[10-11]。近年来，斑马鱼作为一种新型的模式生物，被广泛应用于生命科学及生物医药等相关领域的研究，其实验动物化的基础与其自身所具备的几种生物学优势密切相关：①斑马鱼卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且胚体透明，易于活体观察；②生长发育快，繁殖能力强，受精后24 h主要器官原基基本形成，便于组织器官的发育及功能研究；③个体小，实验室饲养成本低，能大规模繁育[12-13]。此外，随着其基因组测序工程的完成，斑马鱼的基因与人类的基因保守度达到85%，另外具有许多独特、易于鉴别的由基因调控的表型（如体色、鱼鳍等），可形成不同品系，而且细胞标记、组织移植等技术已经成熟，以上均为其成为实验动物的典型提供了强有力的支撑[14]。

2斑马鱼的主要細菌性疾病

实现斑马鱼的实验动物标准化，其核心技术在于对斑马鱼的疾病控制及其健康状态的维持。斑马鱼的疾病发生主要与以下因素有关：斑马鱼的来源及是否与感染鱼群有过接触；饲养的水环境（如水体硬度、温度、溶氧量、致病性微生物污染情况等）饲料的性状及营养；饲养管理的规范化水平等[15-16]。在实验室人工饲养条件下，以细菌为代表的病原微生物则是干扰斑马鱼健康的主要原因[17]。

2.1细菌性败血病细菌性败血病又称为爆发性流行病、出血性腹水病等，具有发病急、流行广、死亡率高等特点，是目前危害斑马鱼健康的最为严重的疾病之一[18]。该病可由嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌等多种病原菌引起，患病鱼的主要症状表现为鱼体各组织器官出现不同程度的出血现象。在发病早期，通过外表观察发现病鱼上下颌、口腔、鳃盖、眼眶、鳍及鱼体两侧轻度充血，剖开腹腔在肠道内仍可见少量食物。随着病情的发展，体表充血现象加剧，肌肉充血，眼球突出，鳃丝末端腐烂，肛门红肿，腹部膨大，此时解剖可见由于内脏器官受损导致腹腔内积有黄色或红色腹水，鳃、肝、肾的颜色较淡，呈花斑状，肠壁充血且无食物[19]。

2.2细菌性烂鳃病细菌性烂鳃病通常是由柱状嗜纤维菌或柱状屈挠杆菌感染所致，该病流行的最适水温为28～35 ℃，主要感染部位为斑马鱼的鳃部[20]。病鱼常伴有离群独游、行动迟缓、体色发黑、呼吸困难、食欲减退以及对外界刺激反应迟钝等症状。肉眼观察可见烂鳃病鱼的鳃瓣呈泥灰色，鳃丝末端尤为严重，黏液增多，鳃盖内表面充血发炎，中间部位常糜烂成1个圆形或不规则的透明小窗，俗称“开天窗”。严重时，鳃小片坏死脱落，鳃丝末端缺损，鳃丝软骨外露；在病变鳃丝的周围常有附着物粘附[21]。

2.3分支杆菌病分枝杆菌病是斑马鱼一种常见的细菌性疾病，又称为结核病，由于斑马鱼对分枝杆菌具有天然的敏感性，因此该细菌对实验斑马鱼构成了巨大的威胁，影响了许多重要的科学实验[22]。国际斑马鱼资源中心（ZIRC）的调查诊断也表明，从1999年9月至2003年6月，分支杆菌占所有感染性的18%[15]，是斑马鱼实验动物化首先要净化的疫病病原之一。该菌属于Actinomycetales纲Mycobacteriaceae科，为抗酸好氧非运动型杆菌。分枝杆菌病属于一种慢性的全身性感染疾病，感染病鱼的主要临床症状表现有为：游动缓慢，无食欲和消瘦，萎靡不振，呼吸急促，眼睛上有雾状物或者眼球突出。头部及体表常可见到充血及边缘清晰的溃疡等类似败血症的症状，最典型的特征是在不同的内部器官上都可以见到多个白色结节（肉芽肿），且结节中心可能伴有坏死现象[23]。

2.4爱德华氏菌病爱德华氏菌病又称为腹水病，发病原因通常是由于迟缓爱德华氏菌感染所致。该细菌为短杆菌，无荚膜，具有运动性，革兰氏阴性，是一种重要的条件致病性人畜共患病原菌[24]。感染病鱼的主要症状表现为腹部肿大，肛门扩张发红，眼球突出且呈白浊化，食欲减退，游动缓慢，部分失去平衡，有时可见鳃或沿脊柱大血管至鳍条有充血现象[25]。

3实验用斑马鱼的细菌质量控制

实验动物被国际学界公认为“活的精密仪器”，其区别于其他动物的最显著特征是其需要实施严格的标准化质量控制[26]。斑马鱼作为鱼类模型动物应用最为广泛的代表，虽已通过纯化培育等方式获得了较高的遗传均一性，但在细菌质量控制及特定病原净化方面与小鼠等法规标准化的实验动物仍存在较大差距，需进一步建立完善无疾病的标准化实验斑马鱼群[16]。

由于水生动物的生物净化相较于啮齿类实验动物存在较多的技术难题，特别是其生活的水环境是各类水生微生物生存繁殖的最佳环境，造成净化工作较难开展及净化后的环境维持困难[27]。为了针对实验用斑马鱼在实验室集约化人工养殖过程中环境的改变及污染可能对斑马鱼健康所造成的威胁实施控制，定期对斑马鱼及其水环境进行细菌学的质量监测则显得尤为重要。

3.1实验用斑马鱼的细菌学监测细菌学监测是微生物学监测的重要组成部分之一，定期对斑马鱼进行细菌学监测是为了了解和控制细菌性疾病在实验斑马鱼中的发生和流行，从而进一步对其微生物质量实施有效控制[28]。针对斑马鱼细菌学质量监测的对象选择问题，需遵循几条原则，具体见表1[29]。

3.2实验用斑马鱼常见病原菌的监测项目在实验室人工饲养条件下，病原菌是干扰斑马鱼健康状态的重要病原，需定期对实验斑马鱼进行细菌学监测，以确保其用于科学实验的质量[15，30]。

目前，我国实验动物细菌学监测标准操作规程的主要内容包括标本的采集、细菌的培养及细菌的鉴定分类。参考我国对实验动物的微生物控制分类[31]，建议将实验用斑马鱼分为普通级和无特定病原体级，其常见的病原菌监测指标主要包括分支杆菌、迟缓爱德华氏菌、气单胞菌、假单胞菌和链球菌等[13，15]。

3.3实验用斑马鱼的细菌检测流程首先，从外观指标上，合格的实验用斑马鱼应外观健康，无异常；其次，需要进一步进行病原微生物指标的检测，不同等级的斑马鱼对病原微生物的检测标准存在一定差异。针对斑马鱼易感的病原微生物检测，主要包括病原微生物的分离和鉴定等内容[5，32]。实验用斑马鱼病原菌的常见检测程序如图1所示。

图1实验用斑马鱼病原菌的检测程序3.4实验用斑马鱼细菌检测中的生物安全控制与预防实验动物细菌检测中的生物安全涉及到以下内容：病原菌的危害与鉴定以及所用到的有害化学药品试剂等。在对实验用斑马鱼细菌检测的实际操作过程中，生物安全水平控制与预防主要取决于以下因素：病原菌的毒力、生物稳定性、致病性、传播途径、传染性及实验室的性能与功能、检测操作技术与方法等，熟悉并掌握其危害根源并做好周全的防范措施是确保生物安全的前提和保障，也是做好实验斑马鱼细菌质量控制的有力后盾[32-33]。

4展望

实验动物的微生物质量控制标准是评价实验动物质量的重要指标，对保证实验研究的顺利进行和工作人员的身体健康以及确保实验数据的准确性等都具有重要意义。细菌检测作為评价实验用斑马鱼微生物质量不可或缺的重要一环，引起了各国实验动物研究机构及科研人员的广泛关注，并已针对某些病原菌的质量控制及检测方法展开了一系列研究。

笔者对实验用斑马鱼这种新型的模式动物进行了简要介绍。斑马鱼本身具有许多形态学和生物学的独特优势，使其在近年来被广泛应用于生命科学等各领域的研究，然而其目前在实验动物的标准化方面还存在欠缺，特别是以斑马鱼的疾病控制与健康状态维持密切相关的病原微生物质量控制问题应引起足够的重视。

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