韭菜粗提取物对柑橘青霉菌的抑菌效果研究

毕璋友　吴惠君

摘要[目的]研究韭菜乙醇粗提物对储藏期柑橘青霉病菌的抑菌作用。[方法]采用粗提物浓度梯度的平板培养法培养柑橘青霉菌，判断不同溶剂和不同处理的粗提物对柑橘青霉菌是否有抑制作用。[结果]以酒精、丙酮和无菌水为溶剂的新鲜韭菜提取物对柑橘青霉菌都有不同程度的抑制作用，且随着浓度的增大抑菌作用增强，随着培养时间的延长抑菌作用降低；以无菌水为溶剂的药液抑制作用最大，24 h时EC50为431.385 μg/ml。以无菌水为溶剂时，不同处理方法所得的韭菜乙醇粗提取物对柑橘青霉菌菌丝生长有明显的抑制作用，以新鲜茎叶对菌丝生长的抑制作用最大，干根次之，以干茎叶的抑制作用最小。[结论]韭菜乙醇粗提物对储藏期柑橘青霉病菌的菌丝有抑菌作用。

关键词韭菜提取物；柑橘青霉菌；抑菌率

中图分类号S436.661.1文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01002-02

基金项目安徽省农产品安全重点实验室开放基金项目（2009Las01）。

作者简介毕璋友（1963-），男，安徽池州人，教授，从事植物病害控制方面的研究与教学。

韭菜（Allium tuberosum）别名起阳草、长生韭、草钟乳等，属于百合科（Liliaceae）葱属（Allium）。韭菜中除含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、胡萝卜素及微量元素外[1]，还富含硫化物[2]、甾体皂苷[3-5]、氮化物[6]和黄酮类等生物活性物质[7]。韭菜汁液及提取物具有杀虫抑菌及抗突变等功效[8]。

柑橘贮运期间青霉病害是柑橘类果品发生最普遍、危害最严重的侵染性病害[9]，目前主要通过低温贮藏和利用化学杀菌剂如咪鲜胺、苯甲酸、对羟基苯甲酸酯等对柑橘防腐保鲜，不仅增加贮藏成本，而且造成环境污染和果品中的农药残留，食用后对人体损害很大[10]。因此，寻找安全、高效、无毒的生物防治方式控制柑橘类果品采后腐烂成为当务之急。植物是生物活性化合物的天然宝库，研究和寻找植物性化合物来保护果蔬贮藏期间免受病菌的侵染更加受到人们的重视。李亚蕾等[11]研究沙葱提取物对酵母菌、青霉、黑曲霉、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑制作用，取得较佳的效果。张香美等[12]利用小根蒜提取物对香椿保鲜，能显著降低香椿的腐烂率。喻林华等[13]发现银杏叶乙醇提取物对柑橘青霉病菌具有较强的抑菌作用。关于韭菜提取物对果蔬贮藏期间防病保鲜的研究较少，笔者旨在探明韭菜乙醇提取物对柑橘青霉的抑制作用，为进一步研究其化合物的类型以及开发和利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂韭菜：购于安庆职业技术学院周边农家，新鲜、无软烂、无霉变，品种为平韭5号，营养生长期。

柑橘青霉病菌（Penicillium italicum）：安庆职业技术学院园林园艺系实验室提供。

99.7%乙醇（上海中秦化学试剂有限公司）、99.7%丙酮（上海试剂厂）。

食物搅碎器（JLL30—B型，顺德市希贵电器制造有限公司），旋转蒸发仪（德国IKA生产，RV1O型，配HB1O水浴锅）。

1.2培养基马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯（切碎成块）20 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，水1 000 ml，pH自然。

1.3韭菜提取物的制备 取新鲜韭菜洗净，晾干，称取200 g放入食物搅碎器中搅拌成菜泥；另分别取晾干的韭菜茎叶及韭菜根若干，放入70 ℃烘箱中烘干，取出干韭菜茎叶和干韭菜根各200 g放入上述食物搅碎器中搅拌，粉碎后密闭保存备用。

将上述新鲜韭菜茎叶泥、干韭菜茎叶粉、干韭菜根粉各200 g分别放入装有500 ml 99.7%乙醇的烧杯中浸渍，并于第3、5、7天提取过滤，将滤液用旋转蒸发仪浓缩至乙醇挥发完全即得韭菜乙醇粗提取物，并将乙醇回收，放于冰箱中密闭冷藏备用。

1.4韭菜粗提取物对柑橘青霉菌的抑菌效果

1.4.1 不同溶剂的新鲜茎叶粗提物对柑橘青霉菌的抑制活性。以无水乙醇、丙酮和无菌水为不同溶剂溶解新鲜茎叶粗提物，配制成2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 mg/ml的粗提物稀释液。用无菌吸管分别吸取2 ml稀释液加入到18 ml的PDA培养基中，充分混匀。同时设置不含粗提物的平板作为对照。待培养基冷却凝固后，在平板上接种直径5 mm的柑橘青霉菌菌碟，26 ℃静置培养，分别于24、48、72和96 h各观察1次，采用十字交叉法测量菌落直径，每处理重复3次。

1.4.2 无菌水为溶剂的不同处理粗提物对柑橘青霉菌的抑制活性 。以无菌水为溶剂，将新鲜茎叶、干茎叶和干根乙醇粗提物配制成2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 mg/ml的粗提物稀释液。用无菌吸管分别吸取2 ml稀释液加入到18 ml的PDA培养基中，充分混匀。同时设置不含粗提物的平板作为对照。待培养基冷却凝固后，在平板上接种直径5 mm的柑橘青霉菌菌碟，26 ℃静置培养，分別于24、48、72和96 h各观察一次，采用十字交叉法测量菌落直径，每处理重复3次。

1.5数据分析 不同溶剂溶解的新鲜韭菜茎叶提取物和不同处理的粗提物对柑橘青霉菌的抑制率按下列公式计算：

抑菌率（%）=对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径-菌碟直径×100

2 结果与分析

2.1 不同浓度溶剂的新鲜茎叶粗提物对柑橘青霉菌的抑制作用由表1可知，在相同培养时间内，随着不同溶剂提取物浓度的增大，3种不同溶剂的新鲜茎叶粗提物对柑橘青霉菌的抑菌效果增强；随着培养时间的延长，提取物对柑橘青霉菌的抑菌效果降低。3种溶剂的新鲜茎叶粗提物在培养24 h后对柑橘青霉菌的抑菌效果最好，提取物浓度为40 mg/ml时，抑菌率达到60%以上，随着时间的延长，以酒精为溶剂的新鲜茎叶粗提物对柑橘青霉菌有较好的抑制作用。对24 h抑菌率（y）与新鲜茎叶粗提物浓度（x）进行毒力回归分析，以酒精、丙酮和无菌水为溶剂分别得到新鲜韭菜茎叶提取物EC50分别为1191.242、1163.729和431.385 μg/ml（表2），以无菌水为溶剂提取物对柑橘青霉菌抑制作用最好。

2.2无菌水为溶剂的不同处理粗提物对柑橘青霉菌的抑制作用由表3可知，在相同培养时间内，不同处理粗提物的浓度与其对柑橘青霉菌的抑制效果成正比；在相同浓度不同处理的粗提物培养基上，随着培养时间的延长，不同处理粗取物对柑橘青霉菌的抑菌效果降低。总体而言，随着粗提物浓度的增大，新鲜茎叶对对柑橘青霉菌的抑制作用最大，干根次之，以干茎叶的抑制率最小。培养24 h其EC50分别为431.385、1 469.199和3 319.913 μg/ml（表4）。

3 小结与讨论

柑橘是我国南方的主要水果之一，采收后常由于机械损伤、贮藏管理不当或微生物的侵染而造成的损失为5%～20%，其中柑橘青霉菌引起的柑橘果实腐烂约占80%[14]。因此，控制柑橘青霉菌的侵染及发展，对于减少柑橘的采后腐烂具有积极作用。在环境保护日益受到重视的今天，植物源农药因具有无污染、不积累、取材容易、费用低廉等优点，成为创新农药品种的主要途径之一。

该研究采用药物浓度梯度的平板培养法培养柑橘青霉菌，测定了韭菜乙醇粗提物对储藏期柑橘青霉病菌的抑菌作用。发现不同溶剂韭菜乙醇粗提取物对柑橘青霉菌有不同程度的抑制作用，且随着浓度的增大抑菌作用增强，随着培养时间的延长抑菌作用降低。以无菌水为溶剂的药液抑制作用最大，24 h时EC50为431.385 μg/ml。无菌水为溶剂的韭菜不同处理乙醇粗提物对柑橘青霉菌的抑制作用表现差异较大，以新鲜茎叶处理所得的粗提取物抑菌作用最强，其次是干根，以干茎叶处理所得的粗提取物抑菌作用最弱，说明韭菜乙醇粗提取物可能对温度较敏感，长时间70 ℃的高温对韭菜乙醇粗提取物的生物活性可能有破坏作用。

该研究采用乙醇作为浸提液，而其他有机物质作为浸提液所提取的粗提物对柑橘青霉菌的抑制作用没有涉及，是否有更好的效果有待以后进一步的验证。韭菜乙醇粗提取物的化学组成、有效毒理成分及毒理等问题也有待进一步的研究。

参考文献

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