浅析昆虫转基因技术中的几类标记基因

何瑜娜　陈代俐　童虹宇　丁奕然

摘要自1982年科学家成功转化出首例转基因果蝇以来，昆虫转基因技术因其潜在的广泛应用前景而成为研究热点。昆虫转基因技术得以实现离不开标记基因的应用，标记基因在筛选转基因昆虫个体上起到关键作用。经过科学家不断探索，转化标记不断改进。文中浅析了昆虫转基因技术中常用的转化标记，并对其最新研究进展进行综述，为昆虫转基因技术的进一步利用提供了依据。

关键词 昆虫转基因技术；眼色标记基因；抗药性标记基因；荧光标记基因；可见显性标记

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-00992-02

作者简介何瑜娜（1993-），女，江苏常州人，本科，专业：生物科学。*通讯作者，本科，专业：生物科学。

收稿日期20140110昆虫转基因技术，即将携带外源基因的DNA导入昆虫的基因组中的技术，所获得的转基因昆虫具有新导入基因表现型特性。已获得成功的转基因昆虫有黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、地中海实蝇（Ceratitis capitata）、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）、家蚕（Bombyx mori）和赤拟谷盗（Tribolium castaneum）等[1]。要将转基因昆虫从野生型种群中快速有效地筛选出来，就要依靠转化标记。将转化标记基因和目的基因一起导入宿主，使转基因个体产生不同的表现型或物化反应，这样就能将转基因个体和野生型个体区分开来。理想的转化标记应该满足表达水平高、范围大、毒副作用小和便于检测等条件[2]。最早使用的转化标记是眼色标记基因和抗药性标记基因，但都有一定局限性。经过探索，科学家建立了目前使用最多的荧光蛋白标记系统，并在此基础上不断发展，逐步完善。

1 眼色标记基因

昆虫眼色基因的突变会改变复眼的颜色，且和正常眼色易于区分。以眼色突变体作为宿主导入目的基因，用正常型眼色基因作为标记基因和目的基因一起转入宿主，在子代中筛选具有正常眼色标志的转基因个体就比较容易。利用这一差异，科学家成功监测转基因地中海实蝇。

但对许多昆虫而言，因缺乏合适的受体突变系，从而使其利用受到限制。目前，眼色标记基因仅应用于果蝇、实蝇和家蝇等昆虫。此外，突变系是近亲交配，其体质没有野生的强壮，这在转化试验中成活率低，有碍于建立纯合的转基因品系[3]。

2 抗药性标记基因

抗药性标记基因首先在冈比亚按蚊中得到应用，利用细菌neo基因编码的新霉素磷酸转移酶II作为选择标记，这种选择是基于对一种氨基糖苷类抗生素抗性[4]。在野生型昆虫中，对药物或抗生素有抗性的种类很多，且由于染色体的位置效应，转化标记的表达水平在转化个体间也存在很大差异[3]。因此，抗药性筛选易于出现假阳性或假阴性，造成筛选准确率低。此外，目前很多致人类疾病的病原菌已对大部分抗生素产生了抗性，若再利用抗药性标记基因，昆虫携带其极有可能会在环境中传播和扩散，会使目前情况更加恶化[5]。因此，抗药性标记基因用作转化标记受到一定限制。

3 荧光标记基因

3.1GFP基因 绿色荧光蛋白（green fluorescentprotein，GFP）是一种最早从水母中分离出，能够自身催化形成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光的蛋白。将目的基因与GFP基因构成融合基因，导入宿主，然后在蓝光或紫外光的激发下便可筛选出转基因昆虫个体。

GFP基因被用作昆虫转基因技术中的转化标记，存在许多优越性。GFP在无任何底物和辅助因子情况下，就能在活细胞内发荧光，且具有荧光稳定、易于观察、表达调控简单和构建载体方便等优点。此外，GFP能与多种蛋白质结合，使表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出荧光特性，这有利于表达产物的分离纯化和活细胞的测定，可以借助荧光显微镜等设备对目标基因的表达产物进行实时示踪；从目前的研究结果来看，GFP对目的基因的结构功能没有影响，对活细胞也基本无毒害，转化后细胞仍可连续传代；由于昆虫中本身不含有GFP，因此用GFP基因作为转化标记准确性强，不会出现假阳性结果[6]。目前，GFP基因已在大量昆虫中成功表达，这表明GFP在昆虫转基因技术中有着广泛的应用前景。

但是，野生型的GFP也存在缺点。比如，长时间的高强度激发光可能使GFP产生自由基，对细胞有毒害[7]。GFP有2个激发峰影响了其特异性，并且长波激发峰强度较小，不易观察。GFP合成及折叠产生荧光的过程慢，蛋白质折叠受温度影响大，表达量较低[8]。另外，以钱永健为代表的众多科学家们通过向GFP引入遗传突变进行改造，进一步突变出了蓝色荧光蛋白（blue fluorescent protein，BFP）、青色荧光蛋白（cyan fluorescent protein，CFP）和黃色荧光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）等，进一步扩大了GFP的应用[9]。

3.2EGFP基因 增强型绿色荧光蛋白（enhanced greennuoreseent protein，EGFP）是GFP的人工改造型，是通过除去GFP基因中隐蔽型内含子、更换GFP生色团氨基酸等方法得到的[10]。EGFP被激发后的荧光强度比野生型GFP高35倍。EGFP是单个吸收峰，与野生型GFP相比特异性更强。实际研究结果表明，以EGFP为基础的标记甚至比眼色基因还要敏感且可靠，其应用范围大大超过眼色标记基因[11]。EGFP和眼色标记基因、抗药性标记基因、野生型GFP基因相比，存在明显的优越性，已成为新一代转基因标记，被广泛的应用于昆虫转基因研究。

3.3精子荧光标记 昆虫遗传防治是昆虫转基因技术的一大应用，即让同种昆虫的不育成员充满一个害虫种群，导致大多数交配不能产生正常发育的后代，而有害基因又可以通过少数有效的交配继续向后代传递，这种策略称为不育昆虫技术（Sterile Insect Technique，SIT）。推进SIT计划的关键就是有效地监测、评估释放昆虫的数量和交配成功率。

Francesca等人报告了地中海实蝇的精子特异性标记系统，这一系统基于特异形成精子的β2-微管蛋白（Ccβ2t）启动子[12]，这样就可以从转基因个体的睾丸或精囊分离出荧光精子。转基因精子标记技术是一个重大的进步，可以改进监测地中海实蝇SIT计划。初步的竞争力分析表明，该标记基本不会有缺陷。这种无害的转基因标记的使用，将推动昆虫转基因技术走出实验室。此外，有效的、易辨认的标记精子有可能推动地中海果蝇生殖生物学的发展，这将有助于进一步推进SIT计划。

4可见显性标记

Mizuko等建立了可见显性标记系统，其依据是使昆虫的黑色素发生变化，从而引起肉眼可見的表型变化[13]。家蚕中芳烷脘-N-乙酰转移酶的超表达，会使初孵幼虫的体色从黑色变成鲜明的浅棕色，整个幼虫阶段和成虫阶段，可观察到芳烷脘-N-乙酰转移酶黑色素沉着被抑制。另外，即使第一龄幼虫体色正常，多巴胺β-丙氨酰-合成酶基因的超表达，也会使大龄幼虫体色变成浅棕色。进一步研究表明，异位表达芳烷脘-N-乙酰转移酶基因，使异色瓢虫和果蝇的体色变浅，这表明这个标记系统在不同昆虫类群的转基因上的潜在应用。

由于一些昆虫有暗色素沉着，加大了荧光检测的难度，使得在荧光显微镜下大量筛选转基因个体是一个艰苦的过程，而新建立的可见显性标记系统可以弥补这一不足。而且，由于黑色素广泛存在于各种昆虫中，这个标记系统将会有比较好的应用前景。

5小结与展望

从最初使用的眼色标记基因和抗药性标记基因，到目前最常用的绿色荧光标记基因，这几种方法基本可以满足昆虫转基因个体的筛选，而新建立的标记系统在一定程度上可以弥补目前使用的标记方法的不足。试验所述的每种标记方法都存在不足，有待科学家进一步研究并改进。虽然这些标记方法使昆虫转基因技术成为现实，但是标记基因存在转基因昆虫体内的安全性，仍然有待评估。

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