中国小家鼠细胞色素b基因序列分析

徐健　靖美东　黄玲

摘要[目的]研究中国小家鼠的细胞色素b基因序列与DNA分类系统。[方法]对来自陕西汉中、新疆乌鲁木齐、云南昆明、湖北武汉和台湾等18个地区的20只小家鼠个体进行基因组DNA提取，细胞色素b基因的PCR扩增和序列测定，并分析碱基组成，构建系统进化树。[结果] 20只小家鼠基因组大小均在20 000 bp以上；小家鼠细胞色素b基因序列中A、T、G、C的平均含量分别为31.6%、29.2%、12.2%和27.0%，个体间碱基组成几乎无差别；汉中、乌鲁木齐等长江以北的12个个体与M.m.musculus的系统发育关系为一支系，昆明、武汉、台湾等8个长江以南的个体与M.m.castanues的系统发育关系较近。[结论]中国小家鼠以长江为界，可分为南北2大亚种，南方为M.m.castanues亚种，北方为M.m.musculus亚种。

关键词中国小家鼠；细胞色素b；系统进化树

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-00989-03

基金项目国家自然科学基金（31371252）。

作者简介徐健（1987- ），女，山东德州人，硕士研究生，研究方向：细胞生物学。

小家鼠（Mus musculus）属啮齿目（Rodentia）鼠科（Muridae）小家鼠属（Mus）动物，是全球性分布的人类共栖鼠类，体型较小，夜出活动，是生物进化、遗传学及生态学研究的理想研究模型。小家鼠作为重要的模式生物，和人类关系密切。其生物地理模式与遗传分化模式可能与人类的迁徙、贸易联系、文化接触和移民活动等直接相关[1]。对其起源和扩散的研究可探讨人类的起源与扩散[2]。此外，小家鼠还对糖尿病、眼疾等人类疾病和免疫缺陷等医学研究领域作出重要贡献。虽然在过去30年里，研究者已经在小家鼠的生物地理学和古生物学方面做了大量研究[3]，在物种的起源进化和扩散历史问题等方面积累了大量资料，但仍然有很多问题尚不清楚。

自1758年林奈命名小家鼠起，各地对于小家鼠亚种的报道也不断增多，但其鉴别依据较为简单粗略，因此有许多同物异名者。随着分子生物学等技术引入小家鼠种群结构的研究，许多学者进一步对其分类系统提出了修改。目前流行的观点认为，小家鼠包括3个亚种，分别是M.m.musculus，M.m.domesticus和M.m.castaneus[4]。其中，M.m.musculus分布在东欧和东北亚地区，M.m.domesticus分布在西欧、中东和北非地区，M.m.castaneus分布在东南亚和印度次大陆[3]。在过去的数百年里，M.m.domesticus已经借由人类活动扩散到了非洲、澳大利亚、南美、北美及许多海洋性岛屿。

我国疆域辽阔，地形地貌丰富，气候状况复杂，地理气候环境的多样性孕育了丰富的小家鼠遗传资源。然而，一直以来针对中国小家鼠的系统地理学研究鲜有报道，有很多问题仍不清楚。其中，中国小家鼠的分类系统不明确。Ellerman和MorrisonScott记录了至少5个亚种[5]。之后，Marshall根据地理分布和形态特征将中国小家鼠区分为3个主要的组群，而Tsuchiya等基于形态特征将其分成了6个亚种。Prager等进行了线粒体DNA序列分析[6]，认为中国内蒙古和北京2个地区的标本属于M.m.musculus。然而，这些最初的基因研究只包含有限的样本，所涉及的地理分布范围不是很广。因此，要想知道中国小家鼠的分类系统，就必须要加大采样范围进行更详尽的研究。

線粒体细胞色素b基因能够为揭示姐妹种或相近种的亲缘关系提供充分的信息[7]，因此是研究脊椎动物分子系统发育关系的有效分子标记[8]。刘晓明、罗静等曾分别对中国西部的绒鼠属和姬鼠属的细胞色素b基因进行过研究，进一步证明了该基因作为属内水平分子系统发育的分子标记的有效性[9-10]。笔者采集了18个地区的小家鼠样品进行试验，测定20个个体的细胞色素b基因的全序列，并将其与GenBank中下载的M.m.musculus（EF108342）、M.m.castaneus（EF108345）和Rattus norvegicus（X14848）的片段进行比对分析，并构建系统进化树，进一步探讨中国小家鼠亚种的分类情况，以期为相关研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料陕西汉中、新疆乌鲁木齐、云南昆明、湖北武汉和台湾等18个采集地的20个小家鼠样品（表1）。取新鲜的鼠尾组织于100%乙醇中带至实验室，-80 ℃保存备用。

1.2样品的扩增与测序剪取保存的小家鼠尾部组织，约绿豆粒大小（2.00 g左右），采用Promega试剂盒方法提取其基因组DNA。采用3对引物（表2），对长度约为1.2 kb左右的细胞色素b基因片段进行扩增。用Takara公司生产的Premix Taq（TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye）进行PCR扩增。扩增结果用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测浓度合适后由上海生工生物工程服务有限公司测序。

2结果与分析

2.1小家鼠基因组DNA提取结果将提取的小家鼠基因组DNA通过电泳检测并通过UVP凝胶成像系统观察，DNA大小均在20 000 bp以上，条带整齐清晰，单一明亮，虽有少许降解，但不影响试验进行。

2.2小家鼠基因组DNA PCR扩增结果取5 μl PCR产物于1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，并通过UVP凝胶成像系统观察，条带整齐清晰，单一明亮，其余保存于4 ℃条件下，留待测序。

2.3DNA序列的碱基组成用Mega 5.2对所测序列进行分析，结果表明，细胞色素b基因的A、T、G、C的平均含量分别为31.6%、29.2%、12.2%和27.0%。除作为外群的大家鼠（Rattus norvegicus，X14848）的碱基含量有些不同外，其余个体间碱基组成几乎无差别（表3）。

2.4系统进化树图1表明，大家鼠Rattus norvegicus（X14848）为外群，20个中国小家鼠个体分成2个大的分支。其中，HZ、YA、DT、CZ、UQ、HF、KZ、CY、SL、LY、BT和MH 这12个小家鼠个体与M.m.musculus（EF108345）小家鼠的系统发育关系较近，共享1个分支，在该分支中，UQ与HF、MH与CY、SL与DT两两分别具有相同的支长。TW1、WH、PX、KM、TW2、TW3、GX和GZ这8个个体与M.m.castanues（EF108342）小家鼠的系统发育关系较近，共享1个分支，在该分支中，WH与PX、TW2与TW3、GX与GZ两两分别具有相同的支长。

小家鼠作为一种重要的模式动物，已经在生物学、医学研究的各个领域得到了广泛的应用，其本身存在的遗传差异也引起了高度的重视[11]。

试验采用试剂盒方法提取小家鼠新鲜冰冻材料的基因组DNA，提取效果较好，用特异引物对基因组DNA进行PCR扩增，结果很好，上海生工生物公司对PCR产物进行测序顺利，结果很好，将测序得到的结果与GenBank中已有的小家鼠序列进行比较，结果表明，扩增和测序结果正确。

通过序列对比发现，20个中国小家鼠个体的细胞色素b基因长为1 144 bp，其碱基序列及含量相差很小，A、T、G、C的平均含量分别为31.6%、29.2%、12.2%和27.0%；AT含量（60.8%）大于GC含量（39.2%），存在显著的AT偏性，每个个体间碱基组成几乎无差别。20个个体的1 144个碱基中，TW1、WH、PX、KM、TW2、TW3、GX、GZ这8个个体有18处碱基不同于HZ、YA、DT、CZ、UQ、HF、KZ、CY、SL、LY、BT和MH这12个个体；此外，还有极少数的几个碱基序列不一致，其余均相同。

试验所用的小家鼠分别来自长江以南，包括台湾省在内的6个地区，以及长江以北的12个地区。其中，大家鼠Rattus norvegicus（X14848）在发育树中处于最外1个分支，与发育树内其他2个分支关系较远；发育树中第2个分支包括M.m.castanues（EF108342）和长江以南6个地区的8个个体（TW1、WH、PX、KM、TW2、TW3、GX、GZ），说明这8个个体属于M.m.castanues亚种；长江以北12个地区的12个个体（HZ、YA、DT、CZ、UQ、HF、KZ、CY、SL、LY、BT和MH）与M.m.musculus（EF108345）构成第3个分支，说明这12个个体属于M.m.musculus亚种。UQ与HF、MH与CY、SL与DT以及WH与PX、TW2与TW3、GX与GZ两两分别具有相同的支长，说明其DNA序列相同，表明它们来自同一母系祖先。这些结果显示，中国小家鼠基因来源较复杂，以长江为界，可分为南北2大亚种：南方为M.m.castanues亚种，北方为M.m.musculus亚种。但由于所用分子标记有限，要想得到更详尽的数据，应进一步扩大采样范围与样品数量，并使用更多的分析标记来进行分析。

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