滑菇Pholiota nameko SW01菌株产漆酶营养条件及部分酶学性质研究

姚良同　魏玮　张建军　贾乐

摘要[目的] 探索滑菇Pholiota nameko SW01菌株产漆酶的最佳营养条件及其酶学性质。[方法] 首先选取不同的碳源、氮源、pH、金属离子进行单因素试验，得到最佳培养基成分，进行四因素三水平的响应面分析。在酶学性质试验中，设置不同温度及pH，测定漆酶的最适反应温度、pH及热稳定性、pH稳定性。[结果] 最适的碳源和氮源分别为葡萄糖和蛋白胨，最适pH为5，Cu2+能显著提高漆酶的产量。响应面分析结果表明，最佳的产漆酶条件为葡萄糖42.50 g/L，蛋白胨2.10 g/L，pH 5.47，Cu2+浓度1.67 mmol/L，在此条件下漆酶活性为943.27 U。在酶学性质试验中，漆酶的最适反应温度为30 ℃，最适反应pH为4.8。[结论] 条件优化能显著提高滑菇漆酶产量。稳定性试验表明，漆酶对温度较敏感，对pH反应不敏感，在弱酸环境中能发挥较高的活性。

关键词漆酶；漆酶性质；优化；Pholiota nameko SW01

中图分类号S509.9文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-00969-03

基金项目山东省食用菌产业体系项目。

作者简介姚良同（1964-），男，山东泰安人，高级实验师，从事食药用真菌方面的研究。*通讯作者，教授，从事食药用真菌方面的研究。

滑菇（Pholiota nameko）又名光帽黄伞、光帽鳞伞、珍珠菇等，属于担子菌纲、伞菌目、丝膜菌科、鳞伞属。滑菇含有丰富的营养物质，其食用、药用价值受到越来越多消费者的青睐。它还是一种具有木质素降解能力的木腐菌，其降解木质素的能力主要取决于一些以木质素为底物的酶类，如漆酶、多酚氧化酶和愈创木酚氧化酶活力等，并且漆酶在木质素降解中发挥中重要的作用。

漆酶（laccase，EC 1. 10. 3. 2）是铜蓝氧化酶家族中的一种多酚氧化酶。按照来源，可分为漆树漆酶（Rhus laccase）和真菌漆酶（Fungal laccase）。现在，用于漆酶生产的主要是一些高等真菌，其中担子菌亚门的白腐真菌产漆酶能力较强[1]。漆酶的底物非常广泛，主要是酚类化合物、芳胺类、芳香羧酸类、甾体激素及生物色素、金属有机化合物等[2-3]。因此，漆酶在木质素降解、环境保护、造纸工业、食品工业等领域具有很大的研究价值和应用价值。另外，利用漆酶进行药物的修饰加工、功能高分子材料的合成也是近年来研究的热点之一[4]。

笔者优化了滑菇SW01菌株产漆酶的营养条件，测定了滑菇在不同条件下生长过程中漆酶活力的变化，并且对漆酶作用的最适条件、漆酶的热稳定性和pH稳定性作了初步研究，为研究滑菇降解木质素的生物作用提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1滑菇（Pholiota nameko SW01）。由实验室保藏。

1.1.2 化学试剂。所用化学试剂均为国产分析纯，购买于当地试剂公司。

1.1.3 培养基。斜面培养基：马铃薯20.00%，葡萄糖2.00%，KH2PO4 0.15%，MgSO4 0.10%，琼脂2.00%；液体基础培养基：葡萄糖20.00%，蛋白胨2.50%，KH2PO4 0.15%，MgSO4 0.10%。

1.2试验方法

1.2.1滑菇液体培养及粗酶液的制备。将100 ml PDA液体培养基装入250 ml三角瓶中，灭菌后接入直径为5 mm的菌种，25 ℃，150 r/min，恒温振荡培养。10 d后取发酵液，5 ℃，3 600 r/min离心15 min。上清液即为粗酶液。

1.2.2 漆酶活力的测定[5]。向试管中加入3.36 mmol/L邻联甲苯胺溶液（用浓度95%乙醇溶解）0.5 ml，再加入0.1 mol/L醋酸盐缓冲液（pH 4.6）3.5 ml、酶液1 ml，混匀，30 ℃水浴，保温30 min，可见分光光度计测600 nm处得OD值。酶活单位1 U=△OD/（30 min· ml）发酵液。取1 ml酶液，沸水浴煮沸5 min，加入0.5 ml 3.36 mmol/L邻联甲苯胺，加入3.5 ml 0.1 mol/L HAC缓冲液（pH 4.6），在30 ℃条件下反应30 min，在600 nm处测OD值，作为空白对照。

1.2.3营养条件优化。

1.2.3.1单因素试验。按基础产酶培养基配方，分別选用利于滑菇生长的碳源（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘露醇）、氮源（蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、酒石酸铵、硝酸铵）、金属离子（Mn2+、Cu2+、Fe2+、Na+、Ca2+）和pH （3、5、6、7、8）进行碳源、氮源、金属离子和pH的单因素筛选试验，以得到最佳碳源、氮源、金属离子和pH。

1.2.3.2响应面设计法（RSM）优化滑菇产酶条件[6-7]。在单因素试验的基础上，应用响应面分析法对滑菇液体深层产漆酶的4种因素在3个水平上进行进一步的优化。选用N=29的RSM设计。每个因素取3个水平，每个水平重复3次。试验设计及结果见表1。用Design Expert 对试验数据进行回归分析。

1.2.4滑菇漆酶性质的初步研究[8]。

1.2.4.1温度对漆酶活性、热稳定性的影响。在不同温度（10、20、30、40、50、60 ℃）下，按上述方法测定漆酶活力。粗酶液在上述温度下保温60 min后，按常规方法测定漆酶活性，以没有经过保温处理的漆酶活性作为对照，计算剩余酶活。

1.2.4.2pH对漆酶活性、稳定性的影响。分别采用不同pH（4.0、4.4、4.6、4.8、5.2、5.6、6.0）的乙酸-乙酸钠（0.2 mol/L）缓冲液配制底物和稀释酶液，按常规方法测定漆酶活力。然后，将粗酶液在上述pH环境中维持60 min （30 ℃），在温度为30 ℃时测定漆酶活力，以没有经过预处理的漆酶活性为对照，计算剩余酶活性。

2 结果与分析

2.1单因素试验由图1可知，在液体培养过程中，滑菇漆酶的产生时间和酶活变化都有很大的差异。在培养初期，经过短暂的适应期后漆酶活性迅速升高，并且在第10天左右酶活达到最高，随后逐渐下降。这可能是因为在接种初期，由于菌丝量较少，其分泌的漆酶量较低，随着菌丝体量的增加，分泌漆酶的量也在增加。以不同的碳源（20 g/L）代替基础产酶培养基中的葡萄糖。图1A显示，以葡萄糖为碳源有利于漆酶的合成。原因可能是葡萄糖能够快速、有效地被菌丝体所利用，产生食用菌生长所需要的能量[9]。图1B显示，以不同的氮源（2.5 g/L）代替来培养菌体，该菌种对硝酸铵、酒石酸铵这样的无机氮源利用率较差，而蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等有机氮源有利于漆酶的合成和积累。这可能是由于无机氮源较难穿过食用菌的细胞膜[10]。在有机氮源中，以蛋白胨为最佳氮源，能明显提高漆酶产量。在以葡萄糖为碳源，以蛋白胨为氮源的培养基中，分别添加不同的金属离子（1.5 mmol/L）。图1C显示，Cu2+优于其他4种离子，对漆酶的产生具有明显的促进作用。有研究表明，Cu2+的促进作用可能与漆酶的结构有一定关系，并且能显著提高其他一些木腐菌漆酶的产生[11-12]。以葡萄糖为碳源，以蛋白胨为氮源，深层培养滑菇。图1D显示，pH为5的酸性环境最有利于漆酶的合成、分泌。pH的高低能够影响酶活性中心的结构、底物的表面结构等，进而影响漆酶的活性、分泌量[13]。

注：A.碳源；B.氮源；C.金属离子；D.pH。

2.3温度对漆酶活性、稳定性的影响由图3可知，在一定范围内，随着反应温度的升高，漆酶活力升高，并且当温度为30 ℃时，酶活达到最高值（354 U）。剩余酶活表明，漆酶活性在20～30 ℃之间保持相对稳定。温度过低或过高，酶活损失均很严重，当温度为60 ℃时，其剩余酶活仅为22.5%，说明漆酶对温度很敏感。

2.4pH对漆酶活性、稳定性的影响采用不同pH的缓冲液，按常规的方法测定漆酶活力。由图4可知，pH在4.4～5.2之间酶活力相对较高，并且当pH为4.8时，漆酶活性42卷4期姚良同等滑菇Pholiota nameko SW01菌株产漆酶营养条件及部分3结论

该研究首先采用单因素试验方法，得到最适合滑菇产漆酶的碳源为葡萄糖，氮源为蛋白胨，pH为5，最适离子为Cu2+。在响应面分析中，建立了以漆酶酶活为响应值的全图3温度对漆酶酶活、稳定性的影响图4pH对漆酶酶活、稳定性的影响变量二次回归方程模型，最终得到最佳的产漆酶条件为葡萄糖42.50 g/L，蛋白胨2.10 g/L，pH 5.47，Cu2+浓度1.67 mmol/L。该条件下的酶活为943.27 U。验证试验说明，该模型可用。在漆酶的性质试验中，漆酶的最适反应温度为30 ℃，最适反应pH为4.8。热稳定性试验表明，漆酶对温度较敏感，当温度大于40 ℃时漆酶的稳定性迅速下降。pH稳定性试验表明，漆酶在弱酸环境中均能发挥较高的活性。

参考文献

[1] 许颖，兰进. 真菌漆酶研究进展[J].食用菌学报，2005，12（1）：57-64.

[2] 宋安东，王艳婕，王松江，等.漆酶的分子生物学研究及其应用[J].信阳师范学院学报：自然科学版，2004，17（2）： 244-248.

[3] BALDRIAN P. Fungal laccasesoccurrence and properties [J]. FEMS Microbiol Rev，2006，30（2）： 215-242.

[4] RIVA S. Laccases： blue enzymes for green chemistry [J]. Trends Biotechnol，2006，24（5）： 219-226.

[5] 王宜磊，劉兴坦. 彩绒革盖菌漆酶及多酚氧化酶活性的研究[J].生物技术，2000（6）： 18-21.

[6] 袁志发，周静芋. 试验设计与分析[M]. 北京： 高等教育出版社，2000：339-346.

[7] 王诗然，赵世光，薛正莲，等. PlackettBurman设计在漆酶发酵培养基主要因子筛选中的应用[J]. 安徽工程科技学院学报，2010（2）：14-17.

[8] 吴旺宝.一株耐高温漆酶真菌的筛选[J]. 安徽大学学报：自然科学版，2007，31（2）：91-94.

[9] GARRAWAY O M，EVANS C R. Fungal nutrition and physiology [M]. New York： John Wiley，1984.

[10] JONATHAN S G，FASIDI I O. Effect of carbon，nitrogen and mineral sources on growth of Psathyerella atroumbonata（Pegler），a Nigerian edible mushroom [J]. Food Chemistry，2001，72： 479-483.

[11] COLLINS P J，FIELD J A，TEUNISSEN P，et al.Stabilization of lignin peroxidases in white rot fungi by tryptophan [J]. Applied and Environmental Microbiology，1997，63： 2543-2548.

[12] GALHAUP C，HALTRICH D. Enhanced formation of laccase activity by the whiterot fungus Trametes pubescens in the presence of copper [J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2001，56： 225-232.

[13] ARDON O，KAREM Z，HADAR Y. Enhancement of laccase activity in liquid cultures of the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus by cotton stalk extract [J]. Journal of Biotechnology，1996，51： 201-207.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（4）：981-982，991