柿树叶片叶绿素含量测定方法比较研究

刘遵春,冯爱英,扈惠灵

（1.河南科技学院,河南 新乡 453003；2.洪官屯镇联合校,山东 茌平 252114）

柿树叶片叶绿素含量测定方法比较研究

刘遵春1,冯爱英2,扈惠灵1

（1.河南科技学院,河南 新乡 453003；2.洪官屯镇联合校,山东 茌平 252114）

以甜柿与涩柿叶片为试材,采用3种不同有机溶剂作为提取液,比较研究了甜柿和涩柿2种柿树叶片叶绿素含量的测定方法.结果表明：采用研磨法提取叶绿素时,溶剂以体积分数为95%的乙醇最好,甜柿叶片叶绿素总含量、叶绿素a含量和叶绿素b含量分别为1.428、1.086和0.341 mg/g,涩柿叶片叶绿素总含量、叶绿素a含量和叶绿素b含量分别为0.951、0.737和0.213 mg/g,均显著高于体积分数为80%的丙酮和二者的混合液；采用浸泡法提取叶绿素时,以体积分数为80%的丙酮和体积分数为95%的乙醇按体积比1∶1混合的混合液提取效果最好,甜柿叶片叶绿素总含量、叶绿素a含量和叶绿素b含量分别为1.478、1.089和0.388 mg/g,涩柿叶片叶绿素总含量、叶绿素a含量和叶绿素b含量分别为1.180、0.886和0.294 mg/g,均显著高于体积分数为95%的乙醇和体积分数为80%的丙酮.两种叶绿素提取方法比较发现,浸泡法优于研磨法.

柿树；叶绿素；有机溶剂；研磨法；浸泡法

柿属柿树科柿树属,原产我国,有3 000多年的栽培历史,是我国一种广为栽培的古老经济树种.叶绿素是植物进行光合作用的重要物质,同时叶绿素的含量也是植物重要的生理指标之一.因此,对柿树叶绿素提取方法的研究意义重大[1-2].早期国际上广泛采用Arnon法测定叶绿素含量[3],但该方法由于先研磨后过滤,工作量大,步骤多,且容易受光氧化而引起测量误差,更不适宜于田间大量样品的测定[4].为此,人们不断研究改进叶绿素的测定方法[5-7].洪法水等研究认为,用丙酮和乙醇的混合液提取植物叶片叶绿素比单一提取液效果要好[8].孙俊宝等分别对体积分数为80%的丙酮、体积分数为95%的乙醇和不同配比混合液的浸提效果进行了深入的研究,得出最适宜提取樱桃叶片叶绿素的混合液为体积分数为80%的丙酮和体积分数为95%的乙醇按体积比1∶1混配的混合液,最佳浸提时间为14 h[9].邓祥元等通过比较不同溶剂及其浓度（体积）、不同萃取时间对桑叶叶绿素萃取效率的影响发现,将丙酮与无水乙醇混合使用可显著提高叶绿素的萃取效率[10].麻明友等采用不同比例的丙酮、乙醇混合试剂,直接浸泡提取猕猴桃叶片叶绿素,发现在35℃、浸泡14 h、液料比=12∶1时,叶绿素提取效果最佳[11].

本试验利用体积分数为80%的丙酮、体积分数为95%的乙醇和丙酮-乙醇混合液（体积分数为80%的丙酮与体积分数为95%的乙醇按体积比1∶1混合）等3种提取液,结合研磨法和浸泡法2种提取方法,对测定柿树叶片叶绿素含量的效果进行了比较研究,旨在为大量柿树叶片样本叶绿素含量的测定提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用甜柿和涩柿叶片均采自河南科技学院园艺园林学院古固寨教学实习基地,每个品种分别采取长枝中上部发育良好、无病虫害的叶片20片.

1.2 试剂与仪器

丙酮、乙醇（均为分析纯）；百分之一天平（上海精天电子仪器有限公司）,722型可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）.

1.3 试验方法

1.3.1 研磨法 在试验田选取生长发育正常、无病虫害的甜柿与涩柿的叶片各20片,将其用蒸馏水洗净,用滤纸吸干,剪去主脉,准确称取0.2 g叶片置于研钵中,加入体积分数为95%的乙醇2～3 mL及少量的石英砂研磨至匀浆,然后将研磨后的样品过滤到25 mL容量瓶中,用体积分数为95%的乙醇清洗研钵、滤纸和杂质至纯白色,洗液滤入容量瓶中,最后分别用体积分数为95%的乙醇定容到25 mL,上下颠倒充分混匀,用722型可见光分光光度计分别在645 nm和663 nm波长下测定光密度值,重复3次.分别用体积分数为80%的丙酮和丙酮-乙醇混合液作对比试验.

1.3.2 浸泡法 在试验田选取生长发育正常、无病虫害的甜柿与涩柿的叶片各20片,将其用蒸馏水洗净,用滤纸吸干,剪去主脉,准确称取0.2 g叶片,迅速剪碎置于50 mL小烧杯中,加入20 mL体积分数为95%的乙醇,置于黑暗处浸泡12 h,并不时摇晃.12 h后,取出待测样品,将上清液倒入25 mL容量瓶中,最后用体积分数为95%的乙醇定容至25 mL,上下颠倒充分混匀,用722型可见光分光光度计分别在645 nm和663 nm波长下测定光密度值,重复3次.并用体积分数为80%的丙酮和丙酮-乙醇混合液作对比试验.

根据Lamber-Beer定律,叶绿素a、叶绿素b与不同波长下光密度值之间的关系式如下：

式中,A645、A663分别为相应波长下的光密度值,V为提取液的体积,m为叶片质量.

2 结果与分析

2.1 采用研磨法不同试剂对柿树叶片叶绿素提取的效果比较

采用研磨法不同试剂对柿树叶片叶绿素提取的影响结果见表1.

由表1可知,采用研磨法提取甜柿叶片叶绿素时,3种不同试剂提取效果存在很大的差异.其中以体积分数为95%的乙醇提取的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量最高,分别达到1.086、0.341和1.428 mg/g,显著或极显著高于其他两种试剂；以用体积分数为80%的丙酮提取的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿含量最低,分别为0.551、0.187和0.739 mg/g.在涩柿叶片叶绿素提取中也表现出类似的变化规律.

表1 采用研磨法不同试剂对柿树叶绿素提取的影响Tab.1 Effect of different agents on chlorophyll extraction by grinding method mg/g

2.2 采用浸泡法不同试剂对柿树叶片叶绿素提取的效果比较

采用浸泡法不同试剂对柿树叶片叶绿素提取的影响见表2.

表2 采用浸泡法不同试剂对柿树叶绿素提取的影响Tab.2 Effect of different agents on chlorophyll extraction by soaking methodm g/g

由表2可知,采用浸泡法提取甜柿叶片叶绿素时,3种不同试剂提取效果存在很大的差异.其中以体积分数为80%的丙酮和体积分数为95%的乙醇按体积比1∶1的混合液提取效果最好,总叶绿素、叶绿素a和叶绿素b含量分别达到1.478、1.089和0.388 mg/g,显著或极显著高于单独使用一种试剂时的提取效果；以单独使用体积分数为80%的丙酮提取柿树叶绿素含量效果最差,叶绿素含量分别仅为1.032、0.813和0.219 mg/g.在涩柿叶片叶绿素提取中也表现出类似的变化规律.

2.3 两种方法提取柿树叶片叶绿素的效果比较

由表1和表2可知,采用2种不同提取方法提取柿树叶片叶绿素时,提取效果存在一定的差异.比较发现,无论对甜柿还是涩柿,采用3种不同试剂提取的效果均表现出浸泡法优于研磨法.因此,浸泡法更适于快速准确地提取柿树叶片叶绿素.

3 小结与讨论

分光光度法测定植物叶片叶绿素含量,由于所用提取溶剂不同,测定结果差异显著[12].一种好的提取溶剂应该提取速度快,叶绿素得率高,稳定性好,测定结果精密度高.本试验结果表明,在室温下用研磨法和浸泡法提取柿树叶片叶绿素,不同提取液表现出不同的趋势：采用研磨法时,体积分数为95%的乙醇提取叶绿素快而完全,表现最好；采用浸泡法提取叶绿素时,体积分数为80%的丙酮和体积分数为95%的乙醇按体积比1∶1的混合液提取效果最好.同时比较2种提取方法发现,研磨法提取叶绿素时,要经过30 min到1 h才能过滤完毕,由于曝光时间长,叶绿素受光氧化破坏,在过滤时又被滤纸吸附了部分叶绿素,不能完全洗涤干净,因此用研磨法得出的结果偏低；而浸泡法不仅大大提高了提取速度,得率上也优于研磨法,这对于测定大量样品叶绿素含量具有实际意义.因此,采用浸泡法,利用体积分数为80%的丙酮和体积分数为95%的乙醇按体积比1∶1的混合液提取柿树叶片叶绿素为最佳方法.

参考文献：

[1] 贺军虎,王永熙,王容花,等.渭北旱区几种柿树光合特性及其适应性的研究[J].西北林学院学报,2003,18（3）：13-15.

[2] 张国良,安连荣,代焕琴,等.柿幼树光合特性的初步研究[J].河北农业大学学报,2000,23（3）：51-53.

[3] 苏正淑,张宪政.几种测定植物叶绿素含量的方法比较[J].植物生理学通讯,1989（5）：77-78.

[4] 孟庆廷.叶绿素提取方法及稳定性研究进展[J].河北化工,2009,32（3）：2-3.

[5] 李得孝,侯万伟,员海燕.玉米叶片叶绿素快速浸提方法研究[J].西北农林科技大学学报：自然科学版,2006,34（11）：65-67.

[6] 明华,胡春胜.浸提法测定玉米叶绿素含量的改进[J].玉米科学,2007,15（4）：93-95,99.

[7] 徐邦发,徐雅丽.棉花叶片的叶绿素含量测定[J].塔里木农垦大学学报,1995（2）：29-32.

[8] 洪法水,魏正贵,赵贵文.菠菜叶绿素的浸提和协同萃取反应[J].应用化学,2001,18（7）：532-535.

[9] 孙俊宝,王建新.樱桃叶绿素含量测定方法研究[J].山西农业科学,2010,38（3）：18-19,33.

[10] 邓祥元,高坤,张丽娟.不同溶剂萃取桑叶叶绿素效率的初步研究[J].中国农学通报,2011,27（2）：389-394.

[11] 麻明友,麻成金,肖桌柄,等.猕猴桃叶中叶绿素的提取研究[J].食品工业科技,2006,27（6）：140-143.

[12] 杨振德.分光光度计测定叶绿素含量的探讨[J].广西农业大学学报,1996,15（2）：145-150.

（责任编辑：邓天福）

Study on chlorophyll extraction methods of leaf in persimmon

Liu Zunchun1,Feng Aiying2,Hu Huiling1
（1.Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China；2.School of Hongguantun Twon,Chiping 252114,China）

With sweet persimmon and astringent persimmon leaves as experimental material,the effects of three extraction solvents and two extraction methods on chlorophyll content were studied.The results showed that,when the chlorophyII was extracted by grinding method,the extraction efficiencies by using 95%ethanol alone were better than mixed solvent or 80%acetone alone.The content of total chlorophyll,chlorophyll a,chlorophyll b in sweet persimmon leaves was 1.428 mg/g,1.086 mg/g,and 0.341 mg/g respectively；The content of total chlorophyll,chlorophyll a, chlorophyll b in astringent persimmon leaves was 0.951 mg/g,0.737 mg/g,and 0.213 mg/g respectively.When the chlorophyll was extracted by soaking method,the extraction efficiencies by using mixed solvent were better than 95% ethanol or 80%acetone alone.The content of total chlorophyll,chlorophyll a,chlorophyll b in sweet persimmon leaves was 1.478 mg/g,1.089 mg/g and 0.388 mg/g respectively；The content of total chlorophyll,chlorophyll a,chlorophyll b in astringent persimmon leaves was 1.180 mg/g,0.886 mg/g,and 0.294 mg/g respectively.When the extraction efficiencies by grinding method was compared with that by soaking method,the latter was better.

persimmon；chlorophyll；organic solvent；grinding method；soaking method

S665.2

A

1008-7516（2014）03-0012-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2014.03.003

2014-02-11

NSFC-河南联合基金（U1304323）；河南省教育厅科学技术研究重点项目（14A210021）；河南科技学院博士科研启动基金（2011014）

刘遵春（1976-）,男,山东聊城人,博士,讲师.主要从事果树栽培教学及研究.