灵芝三萜酸组分高效液相色谱指纹图谱初探

魏晓霞 李鹏 孙红 庄捷

（1福建省立医院药学部，福建福州 350001；2福建医科大学药学院天然药物学系，350004）

灵芝三萜酸组分高效液相色谱指纹图谱初探

魏晓霞1李鹏2孙红1庄捷1

（1福建省立医院药学部，福建福州 350001；2福建医科大学药学院天然药物学系，350004）

目的：建立灵芝三萜酸组分（GLA）的指纹图谱，为其质量控制提供依据。方法：使用植物组织破碎法提取GLA，利用高效液相色谱法建立GLA的指纹图谱。结果：GLA高效液相色谱指纹图谱中有8个峰为其主要特征，其α值分别为0.68，0.73，0.90，0.95，1.00，1.12，1.36，1.46。结论：所建立的RP-HPLC指纹图谱分析方法可为GLA的质量控制提供理论依据。

灵芝三萜酸；指纹图谱；高效液相色谱法

灵芝(Ganoderma lucidum[Leys.ex Fr.]Karst）为多孔菌科（polyproraceae）、灵芝属（Ganoderma）真菌植物赤芝（Ganoderma lucidum[Leys.ex Fr.] Karst）或紫芝（Ganoderma japonicum[Fr.]Lloyd）的干燥子实体[1]。灵芝性温、味甘，多分布于闽、贵、云、冀、苏、吉、浙等省，在我国已有悠久的药用历史，始载于《神农本草经》，具有补中益气、扶正固本、滋补强壮之功效，是一种珍贵的中药材[2]。三萜类化合物是灵芝主要成分之一。其中灵芝三萜酸组分（GLA）是灵芝三萜中的一大类成分，具有多种药理活性，前期研究发现其具有一定抗肿瘤[3]和保肝作用[4]，本实验利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）技术，建立GLA的高效液相色谱指纹图谱，为GLA的质量控制提供实验依据。

1 仪器与药品

1.1 药材

灵芝子实体精粉，3批次（批号GC-L3-20120821、GC-L3-20120922、GC-L3-20121010），由福建仙芝楼生物科技有限公司提供。

1.2 试剂

乙腈、甲醇为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、冰乙酸均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；碳酸氢钠为化学纯（国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 仪器

AB204-E电子分析天平（Mettler Toledo公司）；JHBE-50型闪式提取器（北京金鼐科技发展有限公司）；HH-4型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配二极管阵列检测器，自动进样器；处理软件（Agilent化学工作站）。

2 方法

2.1 供试品制备

将灵芝子实体精粉经无水乙醇闪式提取、抽滤与减压蒸馏后，无水乙醇提取浸膏拌硅藻土后，以石油醚索氏提取除杂后再用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯提取液用饱和NaHCO3溶液萃取，NaHCO3层酸化后再用乙酸乙酯萃取，减压浓缩真空干燥即得GLA[5]。共制备3批次来源于灵芝子实体精粉的GLA样品备用。参照《中华人民共和国药典》RP-HPLC的有关规定[6]，精确称取GLA样品，用乙腈配成10 mg/mL供试品，0.45 μm微孔滤膜过滤，RP-HPLC进样量5 μL。

2.2 色谱条件

依利特C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；填料Hypersil ODS 25 μm（柱号E1720569)；流动相甲醇-水（含2%乙酸），梯度洗脱条件见表1；检测波长252 nm；进样量5 μL；流速0.8 mL/min；柱温35℃。

表1 线性梯度洗脱条件（体积百分比%）

2.3 HPLC分析

取3批次供试品溶液5 μL，注入高效液相色谱仪，自动积分记录色谱图（图1、图2、图3）和各色谱峰的保留时间，以面积归一化法计算各色谱峰的相对峰面积。

图1 GLA的RP-HPLC图（批次GC-L3-20120821）

图2 GLA的RP-HPLC图(批次：GC-L3-20120922)

图3 GLA的RP-HPLC图(批次：GC-L3-20121010)

2.4 相对保留值指纹图谱的确定

选择一个保留时间居中且在各样品中均存在的色谱峰作为参照物，指定它的相对保留时间（relative retention time）α=1，并分别求出样品中各组分的相对保留值为：

式中tR（i）为各组分的出峰时间，tR（s）为参照峰的出峰时间。

以某一样品的色谱峰总面积为分母，各样品中每个色谱峰面积为分子，求得该色谱峰的相对峰面积（ratio of peak area，RA），将它标在其α值项下，最后将各样品的α按由小到大的次序依次排列成行。每个样品色谱峰的相对保留值α和相对峰面积RA构成了其HPLC的指纹特征。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验取同一GLA样品，按2.1制备供试品，连续进样5次，考察主要色谱峰的α和RA的一致性。相对标准偏差(RSD)是试验可信度的一种考察标准，根据检测数据，计算各自的RSD。

2.5.2 稳定性试验取同一GLA样品，按2.1制备供试品，分别在0 h，4 h，8 h，12 h和16 h检测指纹图谱，考察主要色谱峰的α和RA的一致性，并计算各自的RSD。

2.5.3 重现性试验取同一批号GLA样品5份，按2.1制备供试品，考察主要色谱峰的α和RA的一致性，并计算各自的RSD。

3 结果

3.1 GLA色谱图

按2.3进行HPLC分析，得到3批次GLA高效液相色谱图，见图1、图2、图3。

3.2 指纹峰的标定

采用α标定指纹峰，以5号色谱峰作为参照峰，计算各待测峰的α及RA。结果见表2，表3。3批次GLA供试品中含量较高的峰集中在0.90～1.11区域，α值为0.90（峰3），0.95（峰4），1.00（峰5），1.12（峰6）处有4个较强峰；0.68（峰1），0.73（峰2），1.36（峰7），1.46（峰8）处有4个中等强峰。这8个色谱峰的RA均占总峰面积的3.3%以上，说明这8个峰的含量较高，可能是GLA组分中的主要成分。

表2 GLA指纹图谱共有峰相对保留时间（α）

表3 GLA指纹图谱共有峰相对峰面积（RA）

3.3 仪器精密度

分别取同一供试品溶液5 μL，连续进样5次，色谱峰均自动积分。比较不同色谱图中主要色谱峰的α和RA。结果表明，所标定色谱峰的α和RA基本一致，RSD均小于3%，符合指纹图谱的检测要求[7]。说明仪器系统精密度良好。见表4。

表4 GLA的精密度实验数据

3.4 稳定性试验

分别取同一供试品溶液5 μL，每隔4 h进样一次，16 h内连续进样5次，色谱峰均自动积分。比较不同色谱图中主要色谱峰的α和RA。结果表明，所标定色谱峰的α和RA基本一致，RSD均小于3%，符合指纹图谱的检测要求[6]。说明GLA样品性能比较稳定。见表5。

3.5 重现性试验

取同一批号灵芝子实体精粉，按2.1项下方法制备5份供试品溶液。每份样品进样5 μL，色谱峰均自动积分。结果表明，所标定色谱峰的α和RA基本一致，RSD均小于3%，符合指纹图谱的检测要求。所考察的共有色谱峰的重现性良好。见表6。

表5 稳定性实验数据

表6 GLA重现性实验数据

4 讨论

中药的药效是所含有的多种化学成分通过多靶点、多环节发挥综合作用的结果，GLA的药效是多种灵芝三萜酸类成分共同起作用的结果。仅分析测定一种或某几种灵芝三萜酸来评价其质量是不全面的，本文建立的GLA高效液相色谱指纹图谱是GLA中三萜酸类成分整体的综合表达，更能全面评价GLA的质量。因此，GLA的RP-HPLC指纹图谱是控制GLA质量的有效手段，具有一定必要性和先进性。本文所建立的方法得到的色谱指纹图谱多数峰未达到基线分离，因此不适用于GLA的定量控制，但可以作为GLA质量控制中的定性控制方法。通过测定一种或某几种灵芝三萜酸来作为GLA质量的定量控制方法，再结合本文建立的GLA质量的定性控制方法，可以全面控制GLA质量。3批次GLA样品的指纹图谱，各主要色谱峰的α分别为0.68，0.73，0.90，0.95，1.00，1.12，1.36，1.46。这8个色谱峰为3批次供试品的共有指纹峰，是鉴别GLA样品的必要条件之一。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版）一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：174.

[2]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1985：1180-1182.

[3]魏晓霞，李鹏，许建华，等.灵芝三萜组分GLA体内外抗肿瘤作用的研究[J].福建医科大学学报，2010，44（6）：417-418.

[4]李鹏，魏晓霞，南婷婷，等.灵芝三萜酸对小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国医院药学杂志，2013，33（23）：4-8.

[5]徐任生，陈仲良.中草药有效成分提取与分离[M].2版.上海科学技术出版社：218-223.

[6]潘君汉.浅谈中药指纹图谱的意义[J].中国药业，2008，17（6）：13-14.

[7]国家食品药品监督管理局.关于印发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》的通知[J].中国药品标准，2000，1（4）：3.

Preliminary Study on HPLC Fingerprint of Triterpene acids Components from Ganoderma Lucidum

Wei Xiaoxia1，Li Peng2，Sun Hong1，Zhuang Jie1（1 Pharmacy Department of Fujian Provincial Hospital，Fujian Fuzhou 350001，China;2 Department of Natural Medicines of Pharmaceutical College of Medical University，350004）

Objective:To set up the fingerprint of triterpene acids components of ganoderma lucidum（GLA）and to provide a basis for its quality control. Methods:To extract the triterpene acids components of ganoderma lucidum by plant tissue crushing method and to establish the fingerprint of GLA by HPLC.Results:There were 8 characteristic peaks in HPLC fingerprint of GLA，their alpha values were 0.68，0.73，0.90，0.95，1.00，1.12，1.36 and 1.46 respectively.Conclusion: The established RP-HPLC fingerprint can provide a theoretical basis for the quality control of GLA.

Ganoderma lucidum；Triterpene acids；Fingerprint；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.04.006

2014-02-08）

国家自然科学青年基金（81202560）；福建省教育厅科技计划项目（JA11107）；2011年福建省高校产学合作科技重大项目（2011Y4003）

魏晓霞，女，硕士。研究方向：肿瘤药理。通讯作者E-mail：xxwei0321@163.com