辛伐他汀片微生物限度检查方法学验证

王正凤 翟灵妍 陈家香 吴 军

(西南药业股份有限公司 药物研究所，中国 重庆400038)

《中国药典》2 0 10版规定，当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。而对具有抑菌作用的产品，由于在试验条件下存在对待检菌的干扰，使检查结果不能真实的反映药品被污染微生物的量，必须采取一定的方法，如薄膜过滤法、培养基稀释法、中和法或离心沉淀法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，使药品的抑菌作用在该检验条件下无干扰或可以忽略不计，从而顺利检出供试品所污染的各种微生物，更好的控制药品的质量，保证人民的用药安全。辛伐他汀是心血管类药物，为使该药品质量得到较好的控制，笔者采用两种方法来验证辛伐他汀片微生物限度检查法的专属性和有效性。

1 实验材料

1.1 供试样品：辛伐他汀片（规格10mg，批号100901），西南药业股份有限公司生产。

1.2 培养基：营养琼脂培养基（091102）、玫瑰红钠琼脂培养基（090506）、改良马丁培养基（091002）、改良马丁琼脂培养基（091203）、胆盐乳糖培养基（BL）(090701)、营养肉汤培养基（100205）、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）（090302）。

1.3 供试菌种：大肠埃希菌（Escherichiacoli）［CMCC(B)44102］;金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）［CMCC(B)26003］;枯草芽孢杆菌（Bacillussubtillis）［CMCC(B)63501］;白色念珠菌（Candidaalbicans）［CMCC(F)98001］;黑曲霉（Aspergillusniger）［CMCC(F)98003］。以上菌株由重庆药品检验所提供。

1.4 稀释剂及试剂：pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，靛基质试剂，0.9%无菌氯化钠溶液。

1.5 仪器：生物洁净安全柜、压力蒸汽灭菌器、生化培养箱、恒温水浴锅、电子天平、酒精灯、培养皿、锥形瓶、移液管、微生物限度专用检测室等。

2 方法

2.1 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

2.1.1 菌液的制备：接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，在30-35℃下培养18～24h，吸取该培养液1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5-10-7，使溶液中菌数约为50-100cfu/ml。

接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，在23-28℃下培养18-24h，吸取该培养液1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5-10-7，使溶液中菌数约为50-100cfu/m l。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁斜面培养基上，在23-28℃下培养5-7d，加3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4-10-6，使菌数约为 50-100cfu/ml。

2.1.2 培养基的制备：按照说明书进行配制后分装灭菌备用。

2.1.3 供试液的配制：称取供试品10g，加入pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，水浴加热溶解，温度不得过45℃，混匀，作为1:10的供试液。

2.1.4 计数方法的验证（常规法）

1）试验组

细菌数的测定：分别取上述1:10供试液1ml，注入无菌平皿中，并分别加入上述大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌5 0-100cfu的试验菌菌悬液1ml，立刻倾注1 5-20ml的营养琼脂培养基，混匀，凝固，于30-35℃倒置培养2天。

霉菌及酵母菌数的测定：分别取上述1:10供试液1ml，注入无菌平皿中，并分别加入上述白色念珠菌、黑曲霉50-100cfu的试验菌菌悬液1ml，立刻倾注15-20ml的玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，于23-28℃倒置培养3天。

每株试验菌平行制备2个平板，按平皿法测定其菌数。

2）菌液组

在无菌平皿中分别加入上述大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌50-100cfu的试验菌菌悬液1ml，立刻倾注15-20ml的营养琼脂培养基，混匀，凝固，于30-35℃倒置培养2天。

在无菌平皿中分别加入上述白色念珠菌、黑曲霉50-100cfu的试验菌菌悬液1ml，立刻倾注15-20ml的玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，于23-28℃倒置培养3天。

3）供试品对照组

细菌数的测定：分别取上述1:10供试液1ml，注入无菌平皿中，立刻倾注15-20ml的营养琼脂培养基，混匀，凝固，于30-35℃倒置培养2天。

霉菌及酵母菌数的测定：分别取上述1:10供试液1ml，注入无菌平皿中，立刻倾注15-20ml的玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，于23-28℃倒置培养3天。

（4）稀释剂对照组

用pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50-100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

每处理3次重复，分别计算各试验菌每次试验的回收率，求其平均值。

结果表明，本品对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的抑菌作用不显著，回收率均大于70%，可用常规法检验；对大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌均有不同程度的抑菌作用，回收率均低于70%，因此首先采用培养基稀释法。

2.1.5 计数方法的验证（培养基稀释法）

每组除供试液1ml和试验菌1ml均等量分注5个无菌平皿中（每个均加0.2ml）外，其他每组操作同常规法。

结果表明：采用培养基稀释法能够有效的去除本品对大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用，试验组及稀释剂对照组菌液回收率均大于7 0%。

结论：确定本品的细菌数检查采用培养基稀释法测定，霉菌及酵母菌检查采用常规法测定。

2.2 控制菌的验证

按照《中国药典》2010年版规定，本试验所用样品的控制菌检查要求为每1g中不得检出大肠埃希菌，按照规定，验证大肠埃希菌选择金黄色葡萄球菌作为阴性对照菌，因此验证菌株为大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌。

2.2.1 菌液的制备：接种大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，于30-35℃培养18-24h，再用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍系列稀释成浓度为10-100cfu/m l的菌悬液。

2.2.2常规法：1）试验组。取1:10供试液10ml（相当于1g供试样品），加入1ml大肠埃细菌悬液（10-100cfu），接种至100ml胆盐乳糖培养基中，于35-37℃下培养18-24h。2）阴性菌对照组。取供试液10ml和1ml金黄色葡萄球菌悬液（10-100cfu），接种至100ml胆盐乳糖培养基中，于 5-37℃下培养18-24h。

试验组和阴性菌对照组培养18-24h后，分别取上述培养物0.2ml，接种至含5ml MUG培养基的试管内，培养，分别于5和24h时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，则MUG阳性；不呈荧光，则MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加数滴靛基质试液，液面若呈现玫瑰红色，则为靛基质阳性；若呈现试剂本色，则为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。如试剂为MUG阳性，靛基质阴性，或MUG阴性，靛基质阳性，则取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18-24h，观察结果。

结果判断：阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。

试验结果：试验组未检出试验菌，阴性菌对照组未检出阴性菌。结果表明辛伐他汀片对大肠埃希菌有抑制作用，因此采用培养基稀释法消除辛伐他汀片对大肠埃希菌的抑菌作用。

2.2.3 采用培养基稀释法：试验组。方法同以上控制菌检查，区别在于取供试液10ml（相当于供试品1g）和1ml大肠菌悬液（10-100cfu）接种至250ml胆盐乳糖培养基中，35-37℃培养18-24h，其余操作同上。

试验结果：试验组检出试验菌。说明培养基稀释法可用于该样品的控制菌检测。

3 结论

该试验按照《中国药典》2010年版微生物限度检查法中的常规法进行检查，发现试验组对金黄色葡萄球菌，白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率均高于70%，而大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌的回收率均低于70%，说明该供试品具有微弱的抑菌作用，而采用培养基稀释法可消除其抑菌性。而控制菌的检查采用培养基稀释法时阳性菌生长良好，阴性菌金黄色葡萄球菌均未检出，说明该控制菌检查方法的专属性好，可用于控制菌检查。该试验通过对辛伐他汀片的微生物限度检查计数方法的验证及控制菌检查方法的验证，证明了在处方、生产工艺不的情况下，采用培养基稀释法可进行辛伐他汀片的微生物限度检查。