柿子叶中熊果酸的超声波辅助提取工艺研究

曾发挥　陈若菡

【摘 要】为了充分利用柿子叶中的熊果酸，以柿子叶为原料，以熊果酸提取率为指标，采用超声波辅助提取了柿子叶中的熊果酸。分别研究了乙醇浓度、料液比、超声波时间和超声波温度对熊果酸提取率的影响。结果表明，熊果酸提取的最佳工艺条件是：乙醇浓度85%、料液比为1：12、超声波时间为25min、超声波温度为45℃，在最佳条件下，熊果酸提取率可达1.131%。

【关键词】柿子叶；超声波；熊果酸；提取工艺

柿叶为柿树科，柿树属植物柿的新鲜或干燥叶。柿叶味苦、性寒、无毒，治咳喘，肺气胀以及各种内出血。《滇南本草》记载“经霜叶敷臁疮”；《本草再新》记载“治咳嗽吐血，止咳生津”；《分类草药性》记载“治咳嗽气喘消肺气胀”。据报道，柿叶也有抗癌、抗菌、抗衰老、诱导凋亡[1-3]以及对特异性皮炎的作用。经科学研究柿子叶中含有黄酮类、鞣质、香豆精类化合物和树脂、还原糖、多糖及有机酸、胡萝卜素等多种物质，具有抗氧化、降血脂、通利血脉、清热解毒、生津止渴的作用[4-5]。此外，柿子叶尚含有五环三萜类化合物，其中熊果酸是其主要成分之一。

熊果酸（ U rso licA cid，UA ），又名乌索酸、乌苏酸，属A- 香树脂醇型五环三萜类化合物。纯净的熊果酸为白色针状晶体，易溶于二氧六环和吡啶，可溶于甲醇和乙醇，微溶于丙酮、苯、氯仿和乙醚。近年来，有关熊果酸的提取已经成为天然产物加工领域的研究热点之一。随着对熊果酸生物活性的深入研究，其在医药、食品、保健和化妆品等领域获得了广泛的应用[ 6 - 9 ] 。熊果酸在自然界分布很广，是多种天然产物的主要活性成分。目前，熊果酸主要从女贞子、山楂、夏枯草、车前草和苦丁茶等植物中提取[10] ，而很少有在柿子叶中提取的报道，本文对柿子叶中熊果酸的提取工艺进行研究，旨在为以后的研究工作提供参考。

一、材料与方法

（一）材料及仪器

干柿叶，采集于赣南医学院新校区（圆形红柿）洗净、干燥、粉碎后备用；熊果酸对照品，北京澳天茂森生物技术研究院；所用化学试剂中无水乙醇、高氯酸、香草醛、冰醋酸、乙酸乙酯等均为分析纯。

Lambda 35 UV/vis spectrometer紫外可见分光光度计、电子天平、SHB -3型循环水多用真空泵、DZF-6050型真空干燥箱、HHS- 2型电热恒温水浴锅、FW 177粉碎机和Lucky 数控超声波清洗机等。

（二）实验方法

（1）熊果酸的提取

取2 g柿子叶粉，加入适量的浸提液，搅拌，控制超声波温度为45℃，超声波处理25m in。处理后浸泡1 h，然后抽滤，取0. 2mL滤液移至试管中，减压蒸干。冷却后加0. 3 mL5% 香草醛- 冰醋酸和0. 8mL的高氯酸，60℃水浴加热15min，冷却至室温，用乙酸乙酯定容至5 mL，在549 nm波长处测吸光度。

（2）产品的紫外分析

精密量取0. 5mL柿子叶提取溶液，同时量取0. 5mL浓度为0. 2mg /mL的熊果酸标准溶液，分别置于具塞试管中，加热挥去溶剂后，加5% 香草醛- 冰醋酸0. 3 mL 和高氯酸0. 7 mL，然后在60℃水浴中加热15 min，取出冷却至室温。用乙酸乙酯定容至5mL，摇匀，用Cary 50紫外分光光度计进行紫外扫描分析，扫描熊果酸标准品和产品的最大吸收波。

（3）熊果酸标准曲线的绘制

精密称取熊果酸标准品10 mg，用无水乙醇定容于100mL容量瓶中，即得0. 1 mg /mL 的熊果酸标准溶液。分别精密吸取熊果酸标准溶液0.2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9 和1. 0 mL 置于具塞试管中，加热挥去溶剂后，加5% 香草醛- 冰醋酸0. 3 mL和高氯酸0. 8 mL，60℃水浴中加热15 min，取出冷却后移至5 mL聚酯试管中，用乙酸乙酯定容，摇匀后在549 nm处测定吸光度，同时以试剂空白作参比，以吸光度为纵坐标，熊果酸浓度为横坐标，绘制标准曲线，如图1所示。

从图1可以看出，R2 = 0. 9991，说明熊果酸浓度在2～ 10 ug /mL，具有良好的线性关系。

（4）熊果酸提取率的计算方法

式中：Y——熊果酸提取率，%；V——提取液体积，ml；X——熊果酸浓度，μg/ml；W——柿子叶样品质量，g。

二、结果与讨论

（一）产品的紫外分析

对标准品和产品进行紫外分析， 结果如图6和图7所示。

由图6 可知，熊果酸的最大吸收波长在549nm 附近。由图7可知柿子叶提取液在549 nm处出现明显的紫外吸收，由此可以判断出柿子叶中的提取物为熊果酸。

（二）单因素实验

（1）乙醇浓度对熊果酸提取率的影响

按上述试验方法，在超声波时间为30min、超声波温度为50℃和料液比为1：12的条件下，分别取乙醇浓度为75%、80%、85%、90% 和95% 进行试验，计算提取率，结果如图2所示。

图.2 乙醇浓度对提取率的影响

从图2可看出当浓度< 85% 时，随着浓度的增大，熊果酸的提取率显著增加，并在浓度为85%时提取率达到最大；浓度> 85%时，熊果酸的提取率明显下降。故乙醇浓度以85%为宜。

（2）料液比对熊果酸提取率的影响

按上述实验方法，在超声波时间为30min、超声波温度为50℃和乙醇浓度为85%的条件下，液料比分别取1：4、1：6、1：8、1：10、1：12和1：14进行试验，计算提取率，结果如图3所示。

由图3可知，料液比对熊果酸的提取率有显著的影响，随着溶剂添加量的增加，熊果酸的提取率逐渐增大，当料液比达到1：10时，浸提可达到比较理想的效果。此时再增加提取溶剂量对提取率影响不大。考虑到生产成本，故料液比以1：10为宜。

（3）超声波时间对熊果酸提取率的影响

按上述实验方法， 在乙醇浓度为85% 、超声波温度为50℃和料液比为1：12的条件下，超声波时间分别取10、20、30、40和50 min进行试验，计算提取率，结果如图4所示。

由图4可看出，随着超声波时间的延长，熊果酸的提取率也在增加，当超声波时间达到20 min的时候，提取率显著增加，到30 min的时候达到最大值；当超声波时间超过30 min后，提取率开始下降。这是由于提取过程需要一定的超声波时间，超声波时间太短，熊果酸得不到完全的游离，超声波时间过长，过多的醇溶性物质得到游离，从而与熊果酸竞争溶剂，使得熊果酸的提取率下降，故超声波时间以30 min为宜。

（4）超声波温度对熊果酸提取率的影响

按上述试验方法，在乙醇浓度为85%、超声波时间为30 min和料液比为1：12 的条件下，超声波温度分别取30℃、40℃、50℃、60℃和70℃进行试验，计算提取率，结果见图5所示。

由图5可看出，在温度低于50℃ 时，随着超声波温度的升高，熊果酸的提取率呈显著上升趋势，当温度超过50℃的时候，熊果酸的提取率增加缓慢，上升趋势不明显。故超声波温度以50℃比较理想。

三、结论

通过产品的紫外分析表明，柿子叶提取物在549 nm处出现明显紫外吸收，与熊果酸在549 nm处的特征吸收峰相符合，说明柿子叶提取物为熊果酸。

通过分别研究了乙醇浓度、料液比、超声波时间和超声波温度对熊果酸提取的影响，结果表明柿子叶中提取熊果酸的最佳工艺条件为：乙醇浓度为85% 、料液比为1：12、超声波温度为45℃和超声波时间为25min。在最佳提取工艺条件下，提取率为1. 131% 。