不同时期有氧运动对大鼠脑衰老和额叶NCAM表达的影响

林雪灵,李 雪,邓文骞,王璐,杨澎湃,张业廷,袁琼嘉

(成都体育学院运动医学系,四川 成都 610041)

不同时期有氧运动对大鼠脑衰老和额叶NCAM表达的影响

林雪灵,李 雪,邓文骞,王璐,杨澎湃,张业廷,袁琼嘉

(成都体育学院运动医学系,四川 成都 610041)

目的：探讨D-半乳糖致衰老的SD大鼠在衰老前和衰老过程中进行有氧运动对其脑衰老和额叶NCAM表达的影响。方法：3月龄雄性SD大鼠60只随机分成运动预处理组(SD组)、衰老组(ND组)、生理盐水对照组(NNa组)、衰老过程中有氧运动干预组(NDs组),n=15。取材后,测定大脑皮质的SOD、GSH-Px活性和MDA含量,Real-time PCR、Western blotting检测额叶NCAM基因的表达,免疫组织化学检测其表达部位。结果：ND组大鼠较NNa组出现了嗜睡、食欲不振、行动迟缓、毛色枯黄卷曲并大量脱落等衰老体征;ND组SOD、GSH-Px活性非常显著性低于NNa组(P＜0.01),MDA含量非常显著性多于NNa组(P＜0.01),SD组SOD、GSH-Px活性和MDA含量较ND组均无显著性差异(P＞0.05),NDs组SOD、GSH-Px活性非常显著性高于ND组(P＜0.01), MDA含量非常显著性少于ND组(P＜0.01);ND组额叶NCAM基因的mRNA和蛋白质表达水平非常显著性低于NNa组(P＜0.01), SD组额叶NCAM基因的mRNA和蛋白质表达水平较ND组无显著性差异(P＞0.05),NDs组额叶NCAM基因的mRNA和蛋白质表达水平非常显著性高于ND组(P＜0.01),额叶NCAM的免疫产物呈棕褐色,阳性表达主要位于额叶颗粒层细胞周缘的神经元胞浆中。结论：D-半乳糖致大鼠脑衰老造模成功;运动预处理对大鼠脑衰老和额叶NCAM的表达均未产生积极作用;衰老过程中进行有氧运动有效地延缓脑衰老,显著上调额叶NCAM的表达。

有氧运动;衰老;神经细胞粘附分子;额叶;反转录-聚合酶链反应;免疫印迹法;免疫组织化学;大鼠

衰老往往伴随着认知能力下降,记忆障碍和神经退行性疾病的易感性增加[1]。衰老机制有DNA损伤学说[2]、自由基学说[3]、免疫学说[4]、端粒学说[5]、线粒体学说[6]等,其中自由基学说是目前较公认的学说[7]。额叶是空间辨别性学习和记忆的中枢之一,与学习和记忆密切相关[8],神经细胞粘附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)参与了海马、额叶等脑区的轴突生长、神经细胞迁移和分化、神经元的损伤修复、突触可塑性和信号传导等神经活动[9,10]。国内外大量实验表明适宜的有氧运动增强机体的抗氧化能力,延缓脑衰老[11]。本实验通过对D-半乳糖致衰老的SD大鼠在衰老前和衰老过程中分别进行中等负荷的游泳运动干预,观察不同时期有氧运动对大鼠脑衰老和额叶NCAM表达的影响,从分子水平上探讨有氧运动对脑衰老的影响机制,为研究运动与脑健康提供神经分子生物学依据。

1 材料和方法

1.1 动物模型和取材

SPF级3月龄雄性SD大鼠60只,体重400±20g,购自成都达硕生物科技有限公司,生产许可：CSXK (川)2008-24。分笼饲养,自由饮水进食。适应性喂养1周后随机分成4组(见表1)：运动预处理组(SD组)、衰老组(ND组)、生理盐水对照组(NNa组)、衰老过程中有氧运动干预组(NDs组)。

表1 大鼠分组和造模方案

大鼠在透明玻璃缸(160cm×60cm×110cm)内游泳,水深80cm,水温34±2℃。适应性游泳3d(30 min/d)后正式运动,SD组每日19：00进行60min/d的游泳运动,每周训练6d,共4周,之后进行D-半乳糖注射;NDs组每日9：00注射D-半乳糖,19：00进行60min/d的游泳运动,每周训练6d,共6周。采用腹腔注射D-半乳糖6周,100mg/kg/d的注射剂量。根据大鼠的体重,D-半乳糖用生理盐水稀释成5%的浓度(2ml/kg/d)。同时NNa组采用相同的剂量和方法注射生理盐水。按照造模设计时间取材,步骤如下：快速断头取脑,冰生理盐水漂洗,滤纸拭干,置于冰上迅速切离额叶和其余大脑,分装入冻存管后放入液氮罐内保存。

1.2 自由基指标检测

测定大脑皮质的蛋白总量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性和丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量。称量大脑皮质,按W(g)组织块重量/V(m l)生理盐水为1/9加入冰生理盐水,制备10%的组织匀浆。离心10-15min(4℃3,000rpm),用生理盐水将上清稀释成1%的组织匀浆,待测。主要试剂：考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、SODWST-1法测定试剂盒、微量还原型谷胱甘肽测定试剂盒、丙二醛测定试剂盒。均严格按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行操作。

1.3 额叶NCAM的real-time PCR检测

利用Trizol法提取总RNA,检测其在260nm和280nm的吸光度值,确定RNA的纯度和浓度,进行琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性。反转录反应：采用iScriptTMcDNA Synthesis Kit(BIO-RAD)试剂盒,配置反转录反应液：5×iScript reaction mix 4μl,iScript reverse transcriptase 1μl,Total RNA 1μl,Nuclease-free water补足20μl。反应条件：25℃5min,42℃30min, 85℃5min,4℃保温,1 cycle。PCR扩增反应：采用SsoAdvancedTMSYBR®Green Supermix(BIO-RAD)试剂盒,配制反应液：1×SsoAdvancedTMSYBR®Green Supermix 5μl,上游引物(10uM)0.5μl,下游引物(10μM) 0.5μl,cDNA 100ng-100fg,RNase-free water补足10μl。反应条件：95℃30sec 1 cycle,95℃5sec 41 cycle,56℃30sec 41 cycle,65℃-95℃5sec/step 1 cycle。PCR扩增的寡核苷酸引物由TaKaRa宝生物工程有限公司设计合成(见表2)。实验数据采用2-△△ct法分析得出。

表2 引物序列及产物长度

1.4 额叶NCAM的western blotting检测

按1mg组织/20μl裂解液加入裂解液冰中匀浆,超声破膜,冰中静置30min,离心5min(4℃12, 000rpm),上清即为总蛋白样品。在100℃水浴锅进行蛋白变性10min,冷却后分装,-20℃保存。采用碧云天BCA蛋白浓度测试试剂盒进行蛋白浓度测定。取蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离,转膜。将PVDF膜置于8%的脱脂奶粉中室温封闭1h,孵育一抗(ab9018,用8%的脱脂奶粉稀释,浓度1：1000)4℃过夜,37℃孵育二抗2h(山羊抗小鼠,lgG/辣根酶标志,浓度1：2000),将显影液用枪吹洗PVDF膜1min后用保鲜膜覆盖,暗室内压片、显影、定影。结果经扫描后,采用Quantity One分析软件,用条带轨迹定量分析法对图片上的条带进行蛋白表达的相对灰度值测量,以β-actin作内参,分别计算各组额叶NCAM总蛋白的相对表达值。

1.5 额叶NCAM免疫组织化学SABC染色

常规石蜡包埋连续切片,厚4μm,60℃烤箱过夜。石蜡切片脱蜡至水,用3%H2O2室温避光孵育15min,用高压蒸汽锅(129Kpa)进行抗原修复3min,自然冷却至室温,滴加5%BSA置室温20min,孵育一抗(兔IgG一抗/一抗稀释液1：400)4℃过夜,孵育二抗(山羊抗兔IgG)置37℃烤箱20min,滴加SABC置37℃烤箱20min,DAB显色,苏木素复染15min,1%的盐酸酒精分化25s,常规脱水、透明、封片。试剂均购于武汉博士德生物工程有限公司。用Leica光学显微镜进行图像采集,400×光镜下选取5个互不重叠同面积的视野。图像用image pro-plus进行处理,作背底校正后计积分光密度值。

1.6 统计学分析

用SPSS统计软件包处理,计为平均值±标准差(mean±SD)。组间采用单因素方差分析(ANOVA),在P＜0.05和P＜0.01水平上分析显著性差异。

2 结果

2.1 大鼠状态观察

NNa组大鼠精神状态佳、饮食正常、行动敏捷、毛色白有光泽;ND组大鼠出现了嗜睡、食欲不振、行动迟缓、毛色枯黄卷曲并大量脱落等明显的衰老体征。

2.2 自由基检测结果

表3 各组大鼠大脑皮质SOD、GSH-Px活性和MDA含量(M±SD,n=9)

2.3 额叶NCAM的Real-time PCR检测结果

图1 各组大鼠额叶NCAM基因的mRNA表达水平

2.4 额叶NCAM的Western blotting检测结果

图2 各组大鼠额叶NCAM基因的蛋白质表达水平

图3 各组大鼠额叶NCAM的免疫印迹条带

2.5 额叶NCAM的免疫组织化学检测结果

光镜下(400倍)观察切片可见,NCAM的免疫产物呈棕褐色,阳性表达主要存在于额叶颗粒层细胞周缘的神经元胞浆中(见图4)。

3 讨论

3.1 大鼠脑衰老造模验证

采用公认的D-半乳糖致衰老模型[12]。机体内过量的D-半乳糖经半乳糖氧化酶催化为醛糖和过氧化氢,产生超氧阴离子和氧衍生的自由基;或与蛋白质或多肽中的游离胺反应,生成晚期糖基化终末产物(AGEs),致活性氧(ROS)积聚[13]。此外,过量的D-半乳糖可减少颗粒细胞层神经元的迁移和新神经元的生成[14],加速了胆碱能神经元受损,免疫活动减弱,基因表达异常,钙稳态失衡及线粒体功能障碍[15]等,产生与自然衰老相似体征。小鼠或大鼠可在颈背皮下、眼球后或腹腔注射D-半乳糖6-8周,剂量为50-500mg/Kg/d[16],建立衰老模型。Xing-Tai Li等(2010)对小鼠进行颈背皮下注射D-半乳糖(100mg/ Kg/d)7周发现,小鼠肝脏的SOD、GSH-Px活性显著降低(P＜0.001)[17]。彭彬等(2011)报道了长期低剂量注射D-半乳糖引起大鼠空间学习记忆能力下降,脑皮质细胞的抗氧化能力降低等脑衰老表现[18]。本实验通过腹腔注射6周100mg/Kg/d的D-半乳糖建立大鼠衰老模型。大鼠状态观察发现：ND组大鼠较NNa组出现了嗜睡、食欲不振、行动迟缓、毛色枯黄卷曲并大量脱落等明显的自然衰老体征。自由基检测结果显示：ND组大鼠大脑皮质的SOD、GSH-Px活性非常显著性低于NNa组(P＜0.01),MDA含量非常显著性多于NNa组(P＜0.01)。证明本实验D-半乳糖致大鼠脑衰老造模成功。

图4 免疫组化显示各组额叶NCAM表达和分布情况(×400)箭头示阳性细胞,SABC法免疫组化染色。标尺示50μm

图5 各组大鼠额叶NCAM免疫产物IOD值

3.2 不同时期有氧运动干预对大鼠脑衰老的影响

有氧运动并没有抑制脑组织中自由基的产生[22],而主要是通过增强脑组织的抗氧化能力,加快对自由基的消除。而大强度无氧运动或力竭运动会减弱机体的抗氧化能力[11]。长期适宜的有氧运动使机体的抗氧化防御体系对运动产生适应性改变,增强免疫、神经发生和突触可塑性[19],减少星形胶质细胞肥大和髓鞘失调,调节脑血管内皮生长因子(VEGF)[20]、脑源性神经营养因子(BDNF)[23]和神经细胞粘附分子(NCAM)[28]等表达,增加抗炎细胞因子(IL10)水平[1]等,进而延缓脑衰老。SOD是机体内抗氧化系统的首要防御,将超氧阴离子转成过氧化氢,GSH-Px清除脂类氢过氧化物,并在CAT含量很少或过氧化氢产量很低的组织中,可代替CAT清除过氧化氢[12]。MDA是脂质过氧化的代谢产物,其含量反映机体脂质过氧化水平和细胞受自由基攻击的损伤程度[21]。Marosi K等(2012)通过对12月龄雌性Wistar大鼠进行为期15周中等负荷的跑步运动发现,运动组大鼠较对照组出现海马ROS和蛋白羰基量减少,SOD、GSH-Px活性增强,P-AMPK和PGC-1α上调,表明长期有氧运动可提高海马的抗氧化能力,保护神经元在衰老早期免受氧化应激[24]。李垂坤(2011)研究发现60 min/d的游泳运动使小鼠大脑SOD活性升高,MDA含量减少,对延缓脑衰老起到有效的促进作用[25]。本实验自由基检测结果显示：SD组大鼠大脑皮质的SOD、GSH-Px活性和MDA含量较ND组无显著性差异(P＞0.05); NDs组SOD、GSH-Px活性非常显著性高于ND组(P＞0.01),MDA含量非常显著性少于ND组(P＜0.01)。表明衰老过程中进行有氧运动显著增强了大鼠大脑皮质的SOD、GSH-Px活性,减少了MDA含量,有效地延缓脑衰老,与大多文献报道一致。但衰老前进行有氧运动预处理对最终大鼠的脑衰老未产生积极作用,提示大鼠衰老前进行有氧运动对机体所产生的积极作用可能会随着运动的停止而逐渐消退。

3.3 不同时期有氧运动干预对大鼠额叶NCAM表达的影响

NCAM是一种单链膜结合糖蛋白,主要表达于中枢神经系统细胞表面,尤其在海马、额叶等脑区参与轴突生长、信号传导、神经细胞迁移和分化、神经元的损伤修复和突触可塑性等神经活动[11,12]。Aonurm-Helm A(2008)研究发现缺失NCAM的脑区内CREB介导的信号通路异常[26]。袁琼嘉等(2012)报道了长期中等负荷有氧运动提高了大鼠海马NCAM的表达和空间学习记忆能力[27]。本研究结果显示：额叶NCAM的免疫产物呈棕褐色,阳性表达主要位于额叶颗粒细胞周缘的神经元胞浆中。ND组额叶NCAM基因的mRNA和蛋白质表达水平非常显著性低于NNa组(P＜0.01),表明随着大鼠脑衰老,额叶NCAM基因的mRNA和蛋白质表达水平出现下降;SD组额叶NCAM基因的mRNA和蛋白质表达水平较ND组无显著性差异(P＞0.05),表明运动预处理未显著上调额叶NCAM基因的mRNA和蛋白质表达水平,提示大鼠衰老前进行有氧运动对额叶NCAM基因表达的上调作用,可能会随着运动的停止产生了NCAM的泛素化[28]等而逐渐减退,其机制有待于进一步探讨;NDs组额叶NCAM基因的mRNA和蛋白质表达水平非常显著性高于ND组(P＜0.01),与大多数文献报道一致,表明衰老过程中有氧运动可显著上调额叶NCAM基因的mRNA和蛋白质表达,促进衰老大鼠神经元的损伤修复和信号传导等,维持其学习记忆能力。

4 结论

(1)D-半乳糖致大鼠脑衰老造模成功。

(2)运动预处理对大鼠脑衰老和额叶NCAM的表达均未产生积极作用。

(3)衰老过程中进行有氧运动有效地延缓脑衰老,显著上调额叶NCAM的表达,促进大鼠神经元的损伤修复和信号传导。

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Effect of aerobic exercise of different periods on rats brain aging and expression of NCAM gene in frontal lobe

LIN Xue-ling,et al
(Chengdu Sport University,Chengdu Sichuan 610041)

Objective：Aging SD rats induced by injection of D-Galactosewere intervened by aerobic exercise ahead of aging and during aging to explore the effectof aerobic exercise on brain aging and expression level of NCAM in frontal lobe.Methods：60 3-month-old male SD rats were randomly divided into groups SD(aerobic exercise ahead of aging group),ND(aging group),NNa(saline control group)and NDs(aerobic exercise during aging group),n=15.SOD activity,GSH-Px activity and MDA contents in cerebral cortex were determined.Expression level of NCAM in frontal lobewas determined by real-time PCR,western blotting and immunohistochemistry.Results：Group ND,compared with group NNa rats,revealed a lotof obvious aging signs,such as lethargy,loss of appetite,slowness,curly brown hair and shedding;SOD and GSH-Px activity of group ND ratswere significantly lower than group NNa(P＜0.01),MDA content was significantlymore than that of group NNa(P＜0.01),SOD and GSH-Px activity and MDA content of group ND rats had no significant difference from group ND(P＞0.05),SOD and GSH-Px activity of group NDs ratswere very significantly higher than those of group ND(P＜0.01),MDA contentwas significantly less than that of group ND(P＜0.01); mRNA and protein expression level of NCAM gene in frontal lobe of group ND ratswere significantly lower than those of group NNa(P＜0.01).Compared with group ND,mRNA and protein expression level of NCAM gene in frontal lobe of group SD rats had no significant difference(P＞0.05)whilemRNA and protein expression level of NCAM gene in frontal lobe of group NDs ratswere significantly higher than those of group ND(P＜0.01.Immunoreactivities of NCAM in frontallobe were brown,mainly located in neuronal cytoplasm beside the granular cells.Conclusion：Injection of D-galactose induced brain agingmodel rats successful;Aerobic exercise ahead of aging did not have a favorable impact on brain aging and aerobic exercise during aging showed an effective impact on delaying brain aging;Aerobic exercise ahead of aging did not have a favorable impact on expression level of NCAM in frontal lobe and aerobic exercise during aging could significantly increase expression level of NCAM in frontal lobe.

aerobic exercise;aging;neural cell adhesion molecule;frontal lobe;real-time PCR;Western blotting; immunohistochemistry;rat

G804.5

：A

：1001-9154(2014)06-0062-06

G804.5

：A

：1001-9154(2014)06-0062-06

国家自然科学基金(编号：31371202);四川省科技厅科技支撑计划项目(编号：2012SZ0067);国家体育总局、四川省运动医学重点实验室;四川省高校科研创新团队专项基金。

林雪灵(1989-),女,安徽宿州人,硕士研究生,主要研究方向为运动与健康促进。

：袁琼嘉。

2014-05-23