Lipozyme TL IM 酶促酯交换棕榈油中间熔点物制备类可可脂的研究

马 芳，宋海东，魏安池，赵凯艳，郑彦芳

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

0 引言

脂肪酶作为酶类家族中的一员被广泛用于各行各业，其中定向脂肪酶因具有良好的反应区域选择性和立体选择性，可用于特殊油料的改性，从而改善油脂产品的性质，被大量用于油脂化工行业中[1].其中Lipozyme TL IM 属于Sn-1，3 位特异性定向脂肪酶，它只识别水解甘三酯的Sn-1，3 位酯键，可用于特殊油料的改性[2].

近年来，随着食品行业的快速发展，其加工工艺不断提高，类可可脂已经逐渐成为一些糕点涂层、代可可脂巧克力的原料，此类可可脂产品不论是在口感上还是营养上，都要比传统可可脂好[3-4].Daniel Undurraga 等[5]在研究棕榈油中间熔点物（POMF）制备类可可脂时，指出通过棕榈油中间熔点物（POMF）制备类可可脂是可行的，可以获得一个与天然可可脂相近熔点的产品，不过后续的纯化是一个有待解决的问题.Lancelot W Khumalo 等[6]研究目前开发利用较少的植物油脂制备类可可脂时，指出油酸含量分别为68%的Strychnos madagascariensis 油料和59%的Ximenia caffra 油料通过酶促酯交换改性后，表现出良好的可可脂性质，从而不用作为廉价的食用油被开发利用.Kuan-Ju Liu等[7]以猪油为原料，与三硬脂酸甘油酯（StStSt）在超临界CO2的环境下制备可可脂代用品，产品熔点为34.5 ℃.Wang Hai-Xiong 等[8]以茶籽油为原料，与棕榈酸甲酯和硬脂酸甲酯在脂肪酶的作用下制备类可可脂，酯交换后的产品熔点和熔化曲线与天然可可脂的相似.孙晓洋等[9]进一步研究茶油制备类可可脂时提出，使用Lipozyme TL IM 脂肪酶时的不足在于，茶油虽然Sn-2 位富含油酸，不过棕榈酸与硬脂酸的含量低，可考虑选用富含β-POP（Sn-2-油酸-1，3-二棕榈酸甘油酯）或者β-StOSt（Sn-2-油酸-1，3-二硬脂酸甘油酯）等原料制备类可可脂.吴华昌等[10]从油脂甘三酯的角度研究棕榈油中间熔点物（POMF）在无溶剂体系下制备类可可脂，得到与天然可可脂相容性较好的产品，不过其未对酰基位移加以分析.作者通过研究适宜的酶环境和操作条件，以Sn-2 位富含油酸的棕榈油中间熔点物（POMF）为原料制备类可可脂，并对Sn-2 位油酸转移情况进一步分析并优化试验，为制定巧克力配方提供一定的理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料

棕榈油中间熔点物（POMF）：实验室自制；Lipozyme TL IM 脂肪酶：丹麦NOVO 公司；硬脂酸（StA）：天津市风船化学试剂科技有限公司；2’，7’-二氯荧光素：上海金穗生物科技有限公司；薄层层析硅胶G：青岛海洋化工有限公司.

1.2 仪器与设备

SHZ-88 型水浴恒温振荡器：天坛市医疗仪器厂；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；Shimadzu GC-2010 型气相色谱分析仪：苏州科沃安生物科技有限公司.

1.3 方法

1.3.1 产品的制备

在250 mL 单口圆底烧瓶中称10 g 棕榈油中间熔点物（POMF），加热至80 ℃，待POMF 全部熔化后，缓慢加入硬脂酸（StA）并充分混合溶解，取出圆底烧瓶后再加入一定量的Lipozyme TL IM 固定化脂肪酶，然后将圆底烧瓶移至水浴恒温振荡器内反应，振荡速度为150 r/min，在一定温度下反应足够时间.反应完成后，用正己烷洗涤用过的固定化酶，抽滤吸干，最后封存放入冰箱回收利用.所得油样用浓度为83%的乙醇水溶液，在65 ℃的烘箱中萃取5 次，酸价小于3 mg/g 后备用.

1.3.2 全样脂肪酸的组成测定

称取0.1 g 反应物于试管中，加入1.5 mL 正己烷充分溶解后，用带针头的注射器抽取一定量的溶液点样于薄层板上.再将薄层板放入已饱和的展开槽中（展开剂为正己烷∶乙醚∶甲酸=70∶30∶1），待展开剂的液面离薄层底端约1 cm 处时，取出薄层板充分阴干后，用2’，7’-二氯荧光素溶液喷雾处理，然后刮下甘三酯谱带并进一步甲酯化处理，最后离心取上清液进行色谱分析.

色谱条件：检测器：氢焰离子化检测器；毛细管脂肪酸分析柱：120.0 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度：230.0 ℃；柱温：180.0 ℃；检测器温度：300 ℃；氮气流速：1.0 mL/min；氢气流速：46.0 mL/min；空气流速：399.8 mL/min；进样量3 μL.

1.3.3 Sn-2 位脂肪酸的组成测定

参考GB/T 24894—2010/ISO 6800:1997.

1.3.4 评价指标

式中：37.02 是天然可可脂中硬脂酸的质量分数.

式中：66.19 是棕榈油中间熔点物（POMF）的Sn-2位油酸质量分数.

2 结果与分析

2.1 产品主要脂肪酸组成（表1）

表1 主要脂肪酸组成

从表1 可知，天然可可脂脂肪酸特点是Sn-2位以油酸为主[11]，饱和脂肪酸的比例大于不饱和酸.棕榈油中间熔点物（POMF）的Sn-2 位也以油酸为主，与天然可可脂主要脂肪酸类型是一致的，最大的不同在于硬脂酸含量较低.因此通过Lipozyme TL IM 脂肪酶的Sn-1，3 位定向酯交换特性，引入硬脂酸，以硬脂酸酯交换率为指标，Sn-2位油酸的转移率为参考值，分析底物质量比、加酶量、反应温度和反应时间对整个反应进程的影响.

2.2 反应条件的确定

2.2.1 棕榈油中间熔点物（POMF）与硬脂酸（StA）质量比对酯交换率和酰基转移率的影响

在加酶量10%，反应温度60 ℃，反应时间12 h 的情况下考察不同底物质量比对酯交换率和酰基转移率的影响，结果见图1.

图1 底物质量比对酯交换率和酰基转移率的影响

底物的比例会影响反应的速率和平衡.由图1可知，随着硬脂酸加入量的增大，酯交换率呈增大趋势.不过在底物质量比大于1∶1.8 时，因底物物质的量变大，使得促使离子化或是游离的羟基的浓度增大，从而酶周围微水环境的酸度变大，导致了酶的活性下降.同时Sn-2 位油酸的转移率也因反应体系酸度的增加，酶活性的降低而有所降低，因此底物质量比取1∶1.8.

2.2.2 加酶量对酯交换率和酰基转移率的影响

在底物质量比1∶1.8，反应温度60 ℃，反应时间12 h 的情况下，考察加酶量对酯交换率和酰基转移率的影响，结果见图2.

图2 加酶量对酯交换率和酰基转移率的影响

在底物浓度足够大时，Lipozyme TL IM 固定化酶的加入使得酯交换率增加.脂肪酶在整个反应体系中以悬浮状态存在，在150 r/min 的转速下，有利于其在反应体系中的分布.由图2 可知，当酶浓度增加，酯交换率增加明显，不过随着酶浓度的进一步增大，底物与酶的结合区域变化不大，酯交换率增加缓慢.同时酶的增加使得整个反应体系中总水分含量的增多，使得反应趋势向水解方向偏移，造成了酸解反应酯交换率的下降，同时酰基转移率不断增加，因此加酶量取棕榈油中间熔点物（POMF）质量的10%.

2.2.3 反应温度对酯交换率和酰基转移率的影响

在底物质量比1∶1.8，加酶量10%，反应时间12 h 的情况下，考察反应温度对酯交换率和酰基转移率的影响，结果见图3.

图3 反应温度对酯交换率和酰基转移率的影响

由图3 可知，在温度大于55 ℃时酯交换率明显增加，随着温度进一步地升高，在大于65 ℃时酯交换率反而减小.原因是温度在影响酶催化活性的同时会影响底物的黏度，棕榈油中间熔点物（POMF）在较低温度下易凝固，低温影响了反应体系的传质速度，进而使得酯交换率下降.而过高的温度不利于酶的反应，会造成酶的失活，重复使用次数减少，同时较高的温度使得Sn-2 位油酸转移率增加，因此反应温度取60 ℃.

2.2.4 反应时间对酯交换率和酰基转移率的影响

在底物质量比1∶1.8，加酶量10%，反应温度60 ℃的情况下，考察反应时间对酯交换率和酰基转移率的影响，结果见图4.

图4 反应时间对酯交换率和酰基转移率的影响

由图4 可知，反应时间与反应率呈正比关系，反应时间在12 h 后酯交换率降低，理论上随着反应时间的不断加长，酯交换率可以达到100%，不过12 h 后酯交换率增加缓慢，同时随着反应的进行，副产物也会随之增大，酰基转移率增加，不利于反应进程的进一步研究，因此反应时间取12 h.

2.3 正交试验

综合考虑各因素对酯交换率和酰基转移率的影响，取底物质量比1∶1.8，加酶量10%，反应温度60 ℃，反应时间12 h 为中心值，分析这4 个因素对酯交换率的影响，采用正交表L9（34），因素与水平见表2，试验结果见表3，方差分析见表4.

表2 因素与水平

表3 正交试验结果

表4 方差分析

对于酯交换率而言，反应时间的极差最小，作为误差相进行方差分析，得出加酶量和反应温度的显著性高.由于没有交互作用的影响，因此因素B 和C 的搭配一定是最佳的.因素的主次顺序为B（加酶量）为主要因素，以B3（12%）为最好，C（反应温度）为相对次要因素，以C2（60 ℃）为最好，而底物质量比取A2（1∶1.8），反应时间可任意取一个水平.通过酰基转移率的正交分析可知，4 个因素的极差相对比较接近，不利于做进一步方差分析，比较极差值得底物质量比在4 个因素中影响较大，并且以A2（1∶1.8）影响最大.因此，考虑以酯交换率为主要指标，综合得出最优方案为B3C2A2D1.在最优方案下的酯交换率为75.52%，酰基转移率为13.96%.

3 结论

通过正交试验分析，各因素对酶促酯交换棕榈油中间熔点物（POMF）制备类可可脂的影响作用大小为：加酶量＞反应温度＞底物质量比＞反应时间.酯交换最佳条件为：加酶量12%，反应温度60℃，棕榈油中间熔点物（POMF）与硬脂酸（StA）底物质量比1∶1.8、反应时间10 h，在此条件下酯交换率为75.52%，酰基转移率为13.96%.

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