胡椒碱对戊四氮致痫大鼠海马氨基酸递质的影响

杨业勋（宜昌三峡坝区急救中心，湖北 宜昌 443000）

癫痫病因复杂、发病机制至今尚未完全明了，临床治疗困难，祖国医学在癫痫的防治方面做了有益的探索，胡椒长期作为癫痫的治疗药物，而胡椒碱为胡椒抗癫痫的主要有效成份，本研究拟探讨胡椒碱对戊四氮（Pentylenetetrazole，PTZ）制作癫痫大鼠模型行为学以及大脑海马脑组织内谷氨酸和γ氨基丁酸的影响，了解胡椒碱的具体作用机制，为癫痫的治疗寻找更多的方法，为传统中医药的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

戊四氮为Sigma公司产品，胡椒碱粉剂购自山西永健制药，谷氨酸、GABA试剂武汉迈进，Agilent-1100高效液相色谱仪购自上海威临医用仪器有限公司（美国，配有DAD），实验动物由潜江制药动物中心提供。

1.2 动物分组

成年健康雄性SD大鼠48只，体质量215～305g，常规饲养在白天、黑夜正常交替的环境中1周。所选大鼠按照随机化原则分为对照组（control group；CG）、模型组（model group；MG）、胡椒碱组（Piperine group；PG），每组16只。

1.3 模型制备

实验前，所有大鼠称重，PG组于经腹腔注射胡椒碱注射液60mg，MG组和对照组按胡椒碱灯亮生理盐水腹腔注射，再将戊四氮用生理盐水溶解，1h后在MG组和PG组按60mg/kg自腹腔内单次注射戊四氮，对照组按戊四氮等量生理盐水腹腔注射。

癫痫是否发作以及发作程度按采用Racine分并评分，0级：正常，记5分。1级：动嘴、动须、岩棉抽搐，记4分。2级：肢体阵挛、跳起，记3分。3级：四肢及躯干阵挛，双前肢抬起并直立，记2分。4级：强直－阵挛发作、直立并侧身倒地，记1分。5级：全身强直－阵挛发作，记0分。每只大鼠观察分钟，评分3分及以下者则制模成功。

1.4 样本制作

所有大鼠在观察30min后，麻醉快速断头取脑（含海马），用无菌生理盐水冲净血液，三层滤纸吸干水分（不损伤海马），4℃下用电子分析天平称取海马组织的重量，取一研钵，将海马组织放入快速匀浆，不见组织块，然后应用－10℃高速（15000r/min）冷冻离心机离心15min，收集离心后的上清液，无菌过滤保存便于分析。以上所有样品处理过程均在冰块上进行。

1.5 大鼠海马谷氨酸和γ氨基丁酸测定

采用柱前衍生化高效液相色谱荧光法按公司试剂盒给予的方法测定大鼠脑海马谷氨酸（Glu）和γ氨基丁酸的含量。

1.6 统计学分析

谷氨酸（Glu）和γ氨基丁酸的含量值以±s）表示，CG组、MG组和PG组之间的统计学差异用方差分析，每组间的两两比较采用q检验，PG组和MG组行为学评分差异用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学变化

MG组大鼠注射戊四氮后平均54s出现节奏性咀嚼、肢体抽搐、跌倒等表现，而PG组大鼠在注射戊四氮后平均870s出节奏性咀嚼、肢体抽搐等表现，CG组给药前后行为学表现变化。PG组和MG组行为学评分（平均潜伏期）具有统计学差异（P＜0.01）。见表1。

2.2 各组大鼠海马谷氨酸和γ氨基丁酸比较

柱前衍生化高效液相色谱荧光法检测3组实验大鼠海马谷氨酸和γ氨基丁酸含量：MG组及TG组海马谷氨酸含量均较CG组明显增加（P＜0.01），而GABA含量降低，以MG组改变最显著，二者与CG组比较具有统计学差异（P＜0.01）。见表1。

表1 各组实验鼠行为学评分和海马氨基酸递质含量的比较

3 讨论

癫痫是神经系统慢性疾病，病因复杂，机制不清，临床表现多样，目前治疗上主要以药物治疗为主，应用最多的是化学药物，但是长期应用化学药物存在不同程度的副作用，病人难以坚持，因此造成依从性差。祖国医学在癫痫的防治方面做了很多有益的探索，发现了许多可以防治癫痫的单方或者是复方。胡椒是祖国长期用来防治癫痫的药物之一，但是目前机制不清，为了进一步挖掘祖国医学瑰宝，扩大中药的应用，阐明胡椒抗癫痫的机制，因此我们设计此实验。应用戊四氮急性点燃模型，探讨胡椒主要成分胡椒碱对其发作时的癫痫临床表现谷氨酸和γ氨基丁酸的影响，为癫痫的治疗提供新的措施，为祖国医药的深入开发利用提供理论基础。

癫痫的发病机制复杂，涉及离子通道的异常、氨基酸递质失衡、自由基损伤以及免疫异常等，其中中枢神经系统兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸比例失调在原发性癫痫的发病中占有十分重要的位置，因此通过故测定中枢神经系统组织中兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸递质的含量可以反应癫痫的发作程度。许多研究数据证实癫痫患者脑脊液和局部癫痫病灶中谷氨酸和天门冬氨酸的比例较正常人明显量增加，NMDA受体数目也明显增多。同时也好有学者通过动物实验证明，在大鼠侧脑室内注射谷氨酸和/或天门冬氨酸可直接引起动物惊厥，符合人类癫痫的表现，同样一些兴奋性氨基酸受体的激动剂如海人酸也可以引起各种动物产生癫痫样发作，常作为制作癫痫模型的试验药物［1］。在我们的实验中也发现模型组海马谷氨酸含量明显高于对照组，而GABA含量明显低于对照组。因此我们探讨胡椒碱抗癫痫机制，主要探讨其对谷氨酸和GABA的影响，明确其机制及抗癫痫的效用。在我们实验中发现，应用胡椒碱后，癫痫发作的程度明显减低，这主要表现在实验组的发作评分明显低于模型组，表明胡椒碱对癫痫具有防止效果，同时也发现实验组海马谷氨酸含量明显低于模型组，而GABA含量明显高于模型组，说明胡椒碱拮抗癫痫发作通过了调节氨基酸递质的释放机制，但是在我们的实验中还发现，实验组癫痫发作不能完全控制，并且海马谷氨酸含量仍然高于对照组，GABA含量低于对照组，说明单纯胡椒碱应用不能完全控制癫痫的发作，可以是一个很好的辅助用药，但不能完全代替化学药物。

胡椒在祖国医学中是治疗癫痫的住房药物，胡椒碱是胡椒的主要活性成分，属于桂皮酞胺类生物碱，其化学结构特征也决定其有可与受体结合的特征性单元［2］，如氢键接受体、疏水中心和芳环中心等，胡椒碱由于其特殊的药效结构及其天然药物的特性，决定其药理作用十分广泛，其主要药理作用表现在以下几个方面：抗自由基、调节免疫、抑制肿瘤活性、解毒等作用。但是目前对于抗癫痫治疗的机制目前没有做有效的探索，通过我们的实验发现，胡椒碱主要抑制兴奋性氨基酸的释放，促进抑制氨基酸的释放发挥抗癫痫作用。我们的研究取得了理想的结果，但是由于引起癫痫的因素是多方面的，单纯使用胡椒碱治疗癫痫是难以达到初步效果，但是在我们的实验也提示单纯胡椒碱应用不能完全控制癫痫的发作，这主要表现在实验组癫痫发作不能完全控制，并且海马谷氨酸含量仍然高于对照组，GABA含量低于对照组，初步原因考虑癫痫是一个多因素的发病机制，胡椒碱可能只能组织某一条或者其中的几条途径，不能组织所有的途径，因此还需与抗癫痫药物联合应用。

［1］张均田，张庆柱，张永祥.神经药理学 ［M］.北京：人民卫生出版社，2008：608-610.

［2］刘屏，索婧侠，于腾飞.胡椒碱药理作用的研究进展 ［J］.中国药物应用与监测，2007（3）：7-9.

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