转染Cox7a2重组质粒对大鼠支持细胞分泌功能和ERK磷酸化水平的影响*

张 铁刘保兴张秀平徐亚平

1．中日友好医院检验科（北京 100029）；2. 中日友好医院男科；3. 中日友好医院临床医学研究所

·论 著·

转染Cox7a2重组质粒对大鼠支持细胞分泌功能和ERK磷酸化水平的影响*

张 铁1刘保兴2**张秀平2徐亚平3

1．中日友好医院检验科（北京 100029）；2. 中日友好医院男科；3. 中日友好医院临床医学研究所

目的观察大鼠睾丸支持细胞转染细胞色素C氧化酶7a2（Cox7a2）重组质粒后对支持细胞分泌功能及细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化水平的影响。方法培养原代大鼠睾丸支持细胞，将细胞分为空白对照组、空载体组、重组质粒组。将pEGFP-C1-Cox7a2重组质粒转染支持细胞24h后，收集细胞上清液，采用酶联免疫法，测定转铁蛋白（TF）、白细胞介素-1（interleukin-1, IL-1）β、白细胞介素-6（IL-6）含量。Western blot检测ERK的磷酸化水平。结果重组质粒组TF为（14.11±0.45）pmol/mL，显著低于空白对照组（24.3±0.64）pmol/mL和空载体组（25.16± 0.42）pmol/mL（P＜0.01）。重组质粒组IL-1β、IL-6水平分别为（157.14±12.69）pg/mL、（0.79±0.04）pg/mL，显著高于空白对照组（33.05±1.92）pg/mL、（0.25±0.01）pg/mL和空载体组（40.46±6.69）pg/mL、（0.37±0.03）pg/mL，差异均具统计学意义（P＜0.01）。与空白对照组和空载体组相比，重组质粒组ERK1/2磷酸化水平明显增高（P＜0.01）。结论 转染Cox7a2重组质粒后损害了大鼠睾丸支持细胞的分泌功能，提高ERK1/2磷酸化水平。

细胞色素C氧化酶7a2（Cox7a2）; 支持细胞; 细胞外信号调节激酶

睾丸支持细胞在生精过程中起着非常重要的作用, 被称为生精细胞的“保姆细胞”[1-3]。支持细胞为生精细胞提供支架、参与血睾屏障，供给生精过程所需的能量及营养物质，同时能分泌数十种活性物质，其中转铁蛋白（transferrin，TF）是其功能性标志产物，可直接反映支持细胞的功能状态[4,5]。有研究证实：白细胞介素-1（interleukin-1,IL-1）β、白细胞介素-6（IL-6）不仅是促炎性细胞因子而且能调节生精内环境[6,7]。细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）家族的一员，它的信号传递途径是涉及调节细胞生长、发育及分裂的信号网络的核心。细胞色素C氧化酶7a2（Cox7a2）是线粒体细胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase，COX）亚基，与相应细胞分泌功能密切相关。既往我们已经构建了pEGFP-C1-Cox7a2表达载体[8]，本研究观察重组质粒转染大鼠睾丸支持细胞后对支持细胞分泌产物TF、IL-1β、IL-6表达的影响及对ERK磷酸化水平的影响。

材料与方法

一、主要材料和仪器

PCR仪（中国杭州博日科技公司产品），离心机（美国Thermo产品），电泳仪（北京六一仪器厂产品）,酶标仪（美国Thermo产品）。DMEM/F12培养基（美国Sigma公司），Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶（美国Sigma公司），胎牛血清（德国Biochrom公司），TF、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）。兔抗人ERK多克隆抗体及抗p-ERK（Thr202/Tyr204）多克隆抗体（美国Cell Signaling公司），HRP-标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

二、大鼠睾丸支持细胞的分离培养与鉴定

18～21d龄雄性SD大鼠颈椎脱臼法处死，无菌取出睾丸，Hank's清洗后，剥离出睾丸组织，剪碎，加入0.25%胰酶于37℃5%CO2培养箱中消化45mim。加入胎牛血清终止消化，离心（900×g, 3min）×2，去除胰酶；加入0.1%Ⅰ型胶原酶于37℃，5%CO2培养箱中消化20min，加入胎牛血清终止消化，100目细胞筛过滤，加入Hank's液混匀，离心900×g，3min×2，去除胶原酶；加入培养液（DMEM/F12，20%胎牛血清，青霉素100U/mL, 链霉素100U/mL）制成单细胞悬液，48h后，加入20mmol/L Tris-HCL（pH值7.4），继续培养。采用HE染色和Fas-L免疫组织化学鉴定。

三、质粒转染及支持细胞分泌产物（TF、IL-1β、IL-6）测定

将生长状态较好的大鼠支持细胞，分别接种于6孔板中，密度为：5×105左右。培养18h后，将空载体或重组质粒转染原代支持细胞。转染前每个孔加入：500μL无双抗的培养基，每孔加入2μL lipo2000，室温放置5min。分装，50μL/孔。取质粒4μL，用50μLOPti-MEM进行稀释，混合后，室温放置20min。分别对应将脂质体和质粒进行混匀。滴加到细胞培养基中，混匀。37℃CO2培养6h后，将培养基换成含有双抗的600μL培养基。转染24h后，收集细胞上清液，-80℃保存。采用酶联免疫法，波长450nm，测定TF、IL-1β、IL-6含量。

四、ERK磷酸化水平的测定

收集各组细胞，加入RIPA裂解液冰上裂解20 min，4℃ 10 008×g，离心20 min，取上清，BCA法（Pierce公司）蛋白定量。加入SDS上样缓冲液，95℃ 5min，行SDS-PAGE 电泳，上样量为20μg总蛋白。湿转法恒压100v，转膜1 h，室温封闭1 h， 抗p-ERK一抗4 ℃摇床上孵育过夜，二抗（HRP-羊抗兔IgG）室温封闭1 h，ECL显影。显影后PVDF膜经洗脱后二次杂交，此时一抗为抗ERK抗体。胶片经凝胶成像分析系统扫描、成像，（p-ERK/ERK）×100%表示ERK活化水平。

五、统计方法

结 果

一、大鼠睾丸支持细胞鉴定

大鼠睾丸支持细胞形态均一，呈梭形，纯度80%，胞体呈长柱状或不规则状，有多个突起，细胞核为卵圆形或不规则形，位于胞体中央（图1A）。支持细胞HE染色后见：胞体为宽大的柱状或不规则状，有多个粗大的突起，细胞核呈卵圆或不规则形（图1B）。支持细胞经 Fas-L 免疫组化染色见：胞浆及胞膜呈棕黄色着色，为 Fas-L 阳性表达（图1C）。

图1 支持细胞鉴定

二、Cox7a2转染重组质粒对支持细胞分泌产物的影响

与空白对照组和空载体组相比，重组质粒组IL-1β、IL-6水平显著增高，TF水平显著下降 ，差异均具统计学意义（P＜0.01）（表1）。

三、Cox7a2转染重组质粒对ERK磷酸化水平的影响

与空白对照组和空载体组相比，重组质粒组ERK1/2磷酸化水平明显增高（P均＜0.01）（图2）。

表1 各组大鼠支持细胞分泌产物检测结果的比较（）

表1 各组大鼠支持细胞分泌产物检测结果的比较（）

注:*与空白对照组比较P＜0.01;#与空载体组比较P＜0.01

组别 TF IL-1β IL-6 (pmol/mL) (pg/mL) (pg/mL)空白对照组 24.30±0.64 33.05±1.92 0.25±0.01空载体组 25.16±0.42 40.46±6.69 0.37±0.03*重组质粒组 14.11±0.45*#157.14±12.69*#0.79±0.04*#

图2 Cox7a2重组质粒对ERK磷酸化水平的影响

讨 论

Cox7a2是COX的亚基，由细胞核编码，与活性氧的产生和ATP的合成密切相关，为COX维持正常功能所必需[9-11]，转染Cox7a2重组质粒24h后可降低小鼠支持细胞COX活性[12]。Cox7a2转染TM3小鼠间质细胞后，可抑制LH诱导的睾酮分泌，并抑制睾酮合成限速酶-类固醇合成快速调节蛋白StAR的表达[13]。

支持细胞可分泌多种物质，其中分泌的蛋白类主要有转运蛋白和调节蛋白[14]。转运蛋白TF被认为是支持细胞分泌功能的生物学标志。TF是一种能结合铁的蛋白质，能把铁离子从吸收和储存的地方运输到小鼠支持细胞[15]。支持细胞还可以分泌免疫调节因子，如IL-1，其中IL-1β主要通过自分泌或旁分泌来刺激其他的细胞因子和炎症介质产生IL-6等物质[14]。支持细胞是某些影响睾丸生精功能化学毒物的靶细胞，化学毒物对支持细胞分泌功能的损伤表现为TF浓度降低，IL-1β和IL-6浓度升高[16,17]。我们的研究显示：与空白对照组和空载体组相比，转染Cox7a2重组质粒后，支持细胞分泌产物IL-1β、IL-6水平显著增高，TF水平显著下降，表明Cox7a2过表达可损伤支持细胞分泌功能。

ERK是MAPK家族的一员，它的信号传递途径是涉及调节细胞生长、发育及分裂的信号网络核心，活化的ERK可磷酸化核内多种蛋白质，从而影响细胞增殖、发育、分化、存活[18]。研究显示，MAPK家族在氧化剂诱导的信号通路中发挥着重要作用[19,20]，活性氧可激活ERK1/2通路[21]。化学毒物双酚A可降低TF浓度，此过程呈ERK途径依赖性。同时可升高IL-1β和IL-6浓度，此过程呈部分ERK途径依赖性[16]。顺铂也可通过提高磷酸化ERK水平进而降低TF浓度[17]，而壬基苯酚可通过产生活性氧和活化ERK通路使小鼠TM4支持细胞凋亡增加[22]。我们的研究显示：转染Cox7a2重组质粒后，在支持细胞分泌功能损伤的同时ERK磷酸化水平显著升高，但其具体机制尚有待进一步研究。

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（2014-01-10收稿）

Analysis of cell secretion function and the phosphorylation level of extracellular signal-regulated kinase in rat sertoli cell transfected with Cox7a2 recombinant plasmid*

Zhang Tie1, Liu Baoxing2**, Zhang Xiuping2, Xu Yaping3
1. Department of Clinical Laboratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China;
2. Department of Andrology, China-Japan Friendship Hospital; 3.Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital

Liu Baoxing, Email: liubx66@163.com

ObjectiveTo investigate cell secretion function and the phosphorylation level of extracellular signalregulated kinase in rat sertoli cell transfected with Cox7a2 recombinant plasmid.MethodsRat SCs were cultured and divided into three groups such as the control group, the mock group and the recombinant plasmid group. After 24h culture, the culture supernatants of the transfected cells were collected and the levels of transferrin (TF) , interleukin(IL)-1β and IL-6 in culture medium were measured by ELISA. The level of ERK phosphorylation in the transfected cells was detected by Western Blot.ResultsThe level of TF was signif cantly decreased in the recombinant plasmid group as compared with that of the control group and the mock group (P<0.05) .The levels of IL-1β and IL-6 (157.14±12.69 pg/mL and 0.79±0.04 pg/mL) in the recombinant plasmid group were signif cantly higher than those of the control group and the mock group(33.05±1.92 pg/mL, 0.25±0.01pg/mL; 40.46±6.69pg/mL, 0.37±0.03pg/mL,P<0.01), and the level ofERK phosphorylation was also increased signif cantly(P<0.01).ConclusionThe cell secretion function was impaired in rat SCs transfected with Cox7a2 recombinant plasmid but the phosphorylation level of ERK was increased.

Cox7a2; sertoli cells; extracellular signal-regulated kinases(ERK)

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.04.001

R 321.1

资助: 国家自然科学基金（81072809）北京市自然科学基金（7102140）资助项目
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, Email: liubx66@163.com