左炔诺孕酮纳米载药缓释复合材料对人精子活力及超微结构的影响*

刘凯峰魏 勉吕 芳钱 阳顾方乐王 品嵇玉蓉张晓梅**

1. 江苏省苏北人民医院, 扬州大学临床医学院生殖医学中心 （扬州 225001）; 2. 扬州大学化工学院

左炔诺孕酮纳米载药缓释复合材料对人精子活力及超微结构的影响*

刘凯峰1魏 勉1吕 芳1钱 阳2顾方乐1王 品1嵇玉蓉1张晓梅1**

1. 江苏省苏北人民医院, 扬州大学临床医学院生殖医学中心 （扬州 225001）; 2. 扬州大学化工学院

目的研究左炔诺孕酮纳米载药聚乳酸（PLA）-聚苯乙烯（PS）复合材料对人精子活力及超微结构影响。 方法 正常生育男性精液，经密度梯度离心处理后分为空膜组、载药膜组和正常对照组，分别与PLA-PS复合生物膜（空膜）、左炔诺孕酮纳米载药PLA-PS复合生物膜（载药膜）共培养24h，以未加膜培养的精子作为对照，计算机辅助精液分析（CASA）检测精子活力，透射电镜下观察各组精子超微结构的变化。结果（1）共培养24h后各组间精子活力差异无明显统计学意义（P＞0.05）；（2）空膜组精子的超微结构与对照组无明显差别；（3）载药膜组精子的顶体波浪状改变，顶体缺损或消失，质膜溶解，线粒体空泡样变，凋亡精子及崩解精子与空膜组及对照组比较明显增加。结论 PLA-PS复合材料本身对人精子活力及超微结构无明显影响，加入左炔诺孕酮纳米载药的PLA-PS复合材料可使精子超微结构改变，促进精子凋亡，为左炔诺孕酮纳米载药PLA-PS复合材料作为一种安全有效的新型生物可降解纳米载药宫内节育系统提供了进一步的实验依据。

纳米医学; 左炔诺孕酮; 精子; 避孕

左炔诺孕酮纳米载药缓释复合材料已为广大有避孕要求的女性带来新的选择。纳米载药缓释复合材料具有不改变药物性状，减少药物的使用量、降低药物毒副作用、增加药物的稳定性、可提高作用时间和效果、可有效避免降解核苷酸的作用等优势。研究发现将纳米粒子复合于生物材料中利于纳米粒子的载药、缓释等性能[1]。有研究报道左炔诺孕酮联合十一酸睾酮可抑制精子的生成[2]，但左炔诺孕酮纳米载药缓释复合材料对男性精子的活力及精子细胞超微结构的影响还没有相关文献报道。本研究探讨左炔诺孕酮纳米载药聚乳酸（PLA）-聚苯乙烯（PS）复合材料对人精子活力及超微结构影响，以进一步研究生物可降解纳米载药缓释宫内节育系统的构建，为其作为新型避孕系统提供实验依据。

材料与方法

一、左炔诺孕酮纳米载药材料的制备

将PLA、PS及载有左炔诺孕酮纳米颗粒的PS在真空干燥箱，60℃的条件下干燥12h；将45g PLA和5g PS或5g 载有左炔诺孕酮纳米颗粒的PS加入Haake转矩流变仪进行共混，熔融共混温度为180℃，时间为8min；在170℃、10MPa的条件下用平板硫化仪将复合材料压成片材[3]。

二、人精子悬液的制备

3名精液质量正常的男性，禁欲3～7d后手淫法留取精液于无菌取精杯中，液化后充分混匀，采用密度梯度离心法处理精液，即取1.5mL 80% SpermGrad（Vitrolife）加人锥形离心管内, 用无菌巴斯德吸管缓慢于其液面上方加入1.5mL 40% SpermGrad，将2.0mL精液加至密度梯度上部，400×g，离心15min，将管底精子沉淀吸于5.0mL 试管内，加入3.0mL IVF精子洗涤液，重悬洗涤，200×g，离心6min，去除上清液，精子沉淀加入IVF精子处理液制备成5×107/mL密度的精子悬液待用。

三、左炔诺孕酮纳米载药缓释材料与精子共培养

每份精子悬液分为空膜组、载药膜组和正常对照组，每组200μl。无菌条件下将PLA-PS复合材料（空膜）及左炔诺孕酮纳米载药PLA-PS复合材料（载药膜）剪成1mm×1mm大小，分别取20片置入200μl 精子悬液中，即为空膜组和载药膜组，以未添加复合材料的精子为空白对照，37℃ CO2培养箱孵育24h 后，用计算机辅助精液分析（CASA）检测精子活率及活力，每组重复3次。

四、精子的透射电镜检测

取孵育24h 后的各组精子，1000rmp 离心5min。弃上清液，将沉淀物用2.5%戊二醛固定。 常规电镜包埋切片，观察。每组精子做50个纵切（精子头部能见典型核型态）和50个横切（精子尾部见典型轴丝结构）。

五、统计学方法

结 果

一、左炔诺孕酮纳米载药复合材料对人精子活力的影响

空膜组、载药膜组精子活动率（A+B+C级精子）与对照组相比，差异无明显统计学意义（P＞0.05），空膜组、载药膜组精子活力（A级精子+B级精子）与对照组相比，差异也无明显统计学意义（表1），说明PLA-PS复合材料及左炔诺孕酮纳米载药PLA-PS复合材料对精子活率及活力无明显影响。

表1 左炔诺孕酮纳米载药缓释材料对人精子活率及精子活力的的影响

二、左炔诺孕酮纳米载药复合材料对人精子超微结构的影响

对照组精子：外形正常，结构完整, 双层膜性结构和赤道板清晰, 顶体内含物电子密度中等；核呈梨状形，核染色质电子密度均匀；尾部线粒体分布规则, 大小形态较一致，微管结构完好。空膜组精子超微结构较对照组无明显变化（图1）。载药膜组精子顶体波浪状改变，顶体缺损或消失，质膜溶解，线粒体空泡样变, 凋亡精子及崩解精子明显增加（图2）。

图1 正常精子和空膜组

图2 载药膜组

讨 论

聚乳酸（PLA）是一种具有优良的生物相容性和可生物降解性的合成高分子材料，具有无毒、无刺激、可塑性好、易于加工成型不污染环境等优点，已被美国食品医药局（FDA）批准，可用作医用手术缝合线、注射用胶囊、微球及埋植剂等。将PLA作为纳米微粒载药材料应用于临床也是近年来研究热点[4,5]。但因其亲水性差、强度低、脆性高、热变形温度低、抗冲击性差、降解周期难以控制、价格贵，目前通过增塑、共聚、共混和复合等改性方法来改进PLA的力学性能，从而更好地满足生物医用以及环保的应用。聚苯乙烯（PS）具有高强度、成本低等优点，本研究将PLA和PS按9:1的质量比共混合成生物膜，达到了环保和力学性能的平衡。左炔诺孕酮是目前应用较广的避孕药[6]，是一种强效孕激素，主要作用于下丘脑和垂体，使月经中期FSH和LH水平的高峰明显降低或消失，可以抑制排卵并阻止孕卵着床，同时使宫颈黏液变稠阻碍精子穿透，其在女性避孕方面是对子宫内膜的局限性作用，是可逆的，卵巢分泌激素不受影响[7]。本研究制备了左炔诺孕酮纳米载药缓释PLA-PS复合材料，并观察其对男性精子的活力及精子细胞超微结构的影响。

精子顶体因含有透明质酸酶、顶体蛋白酶、神经酰胺酶等，在受精过程中有重要的作用[8]。本研究制备的PLA-PS复合材料本身对人精子活力及超微结构无明显影响，证实了该复合材料的生物安全性，而左炔诺孕酮纳米载药的PLA-PS复合材料可使精子顶体波浪状改变，质膜溶解，顶体缺损或消失，提示左炔诺孕酮能损坏精子顶体，使精子顶体中所含的各种酶丢失，从而丧失受精能力。

精子中的线粒体通过呼吸底物氧化磷酸化作用产生能量，糖酵解可以通过底物水平磷酸化提供额外的能量，支持人类精子的运动[9]。本研究制备左炔诺孕酮纳米载药的PLA-PS复合材料可使精子线粒体发生空泡样变,理论上可影响琥珀酸脱氢酶（SDH）及乳酸脱氢酶（LDH）的供能，使ATP产生受阻，精子细胞的前向运动能力下降。但本研究发现左炔诺孕酮纳米载药PLA-PS复合材料对精子活力无明显影响，可能与样品例数少，作用时间，作用方式有关，有待增加样品例数和增加作用时间，进一步研究。

构成精子鞭毛的轴丝复合体包含9根双联微管，成圆形排列，通过连接蛋白相互连接，并通过放射辐与一对中央微管上中央鞘相连接，各对二联体微管之间的相对滑动引起尾部的摆动，依靠水解ATP以供给能量[9]。本研究未发现左炔诺孕酮纳米载药的PLA-PS复合材料对精子细胞的9+1轴丝结构有影响。

由本研究结果示左炔诺孕酮纳米载药的PLA-PS复合材料可使精子顶体异常，质膜溶解，线粒体空泡样变，促进精子凋亡。为左炔诺孕酮载药PLA-PS复合材料作为一种新型的宫内节育系统运用于临床提供研究基础。但这仅是从细胞形态学上观察左炔诺孕酮纳米载药的PLA-PS复合材料的作用，若进一步揭示作用机制，仍需进一步研究，如研究左炔诺孕酮纳米载药的PLA-PS复合材料对精子细胞线粒体内氧化磷酸化过程的影响等。

1 嵇玉蓉, 魏勉, 张晓梅. 生物可降解纳米载药缓释宫内节育系统的构建及应用前景. 中国医药导刊 2012; 14 (12): 2025-2027

2 刘思天, 桂幼伦, 林翠红, 等. 左炔诺孕酮(LNG)配伍十一酸睾酮(TU)对精子生成抑制差异的研究. 中国计划生育学杂志 2003; 11(12): 734-738

3 张晓梅, 王大新, 吕芳, 等. 生物可降解纳米载药缓释宫内节育器及其制备方法:中国.201310008740.5[P].2013-4-17

4 Chen CK, Law WC, Aalinkeel R,et al. Biodegradable cationic polymeric nanocapsules for overcoming multidrug resistance and enabling drug-gene co-delivery to cancer cells.Nanoscale2014; 6(3): 1567-1572

5 Zhang C, Chen J, Feng C,et al.Intranasal nanoparticles of basic f broblast growth factor for brain delivery to treat Alzheimer's disease.Int J Pharm2014; 461(1-2): 192-202 6 Beasley A, Schutt-Ainé A. Contraceptive procedures.Obstet Gynecol Clin North Am2013; 40(4): 697-729

7 张莉嘉, 翁梨驹. 左炔诺孕酮宫内系统临床使用五年的安全性研究. 中华妇产科杂志 2001; 36 (11): 675-677

8 张蕴晖, 汪玉宝, 李卫华, 等. 苯扎溴铵对人精子细胞超微结构的影响. 环境与职业医学 2002; 19(2): 71-73

9 李宏军, 李汉忠. 男科学-男性生殖健康与功能障碍(第3版). 北京大学医学出版社, 2013: 62

（2014-01-20收稿）

Effects of sustained-released levonorgestrel nanoparticle composites on human sperm motility and ultrastructure*

Liu Kaifeng1, Wei Mian1, Lv Fang1, Qian Yang2, Gu Fangle1, Wang Pin1, Ji Yurong1, Zhang Xiaomei1**
1.Northern Jiangsu People's Hospital, Clinical College of Yangzhou University, Reproductive Medicine Center, Yangzhou 225001, China; 2.Chemistry and chemical engineering college of Yangzhou university

Zhang Xiaomei, E-mail: zhangxiaomeiyz@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of levonorgestrel-loaded nanoparticle composites on human sperm motility and ultrastructure.MethodsSemen samples from normal reproductive males were collected anddivided into empty biofilm (polylactic acid-polystyrene composite biofilm) group, drug-loaded biofilm(levonorgestrel-loaded nanoparticle polylactic acid-polystyrene composite biofilm) group and normal control group. After co-culture with empty biof lm or drug-loaded biof lm for 24 hours, sperm motilityand sperm ultrastructure were detected by CASA and transmission electron microscope respectively.Results(1) No signif cant differences were observed in sperm motility among groups. (2) Compared with that of the control group, no obvious difference in sperm ultrastructure was found in empty biof lm group. (3) Remarkable differences were observed in drug-loaded biof lmgroup such as wavy change, defect or disappearance of acrosome, plasma membrane dissolved, vacuolar degeneration of mitochondria, as well as a signif cant increase in sperm apoptosis and disintegration of sperm.ConclusionPolylactic acid - polystyrene composites itself has no effects on human sperm motility and ultrastructure, levonorgestrel-loaded nanoparticle polylactic acid-polystyrene composites has obvious effect on human sperm acrosome, plasma membrane, mitochondria and promotes sperm apoptosis, which provides the theoretical basis for further study of biodegradable sustained-released nanoparticle drugloaded intrauterine contraceptive system.

nanomedicine; levonorgestrel; spermatozoa; contraception

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.05.002

R 979.2

资助: 国家自然科学基金青年基金项目（81100421）; 江苏省科技支撑计划-社会发展项目（BE 2010698）
**

, E-mail: zhangxiaomeiyz@163.com