小鼠局灶性脑缺血模型的比较分析

赵 强，朱伟杰，王芙昱，佟怀宇，许百男

1解放军总医院 神经外科，北京 100853；2河北省保定市第一医院 神经外科，河北保定 071000

综 述

小鼠局灶性脑缺血模型的比较分析

赵 强1,2，朱伟杰1，王芙昱1，佟怀宇1，许百男1

1解放军总医院 神经外科，北京 100853；2河北省保定市第一医院 神经外科，河北保定 071000

小鼠局灶性脑缺血模型是研究缺血性脑血管病的重要工具，可以帮助我们更好地了解局灶性脑缺血的发病机制。本课题组对小鼠局灶性脑缺血模型中最常用的线栓插入法、开颅手术电凝闭塞法、光化学诱导法、栓子栓塞法分别进行综述介绍。

模型；小鼠；局灶性脑缺血；脑梗死

动物局灶性脑缺血模型是模拟人类缺血性脑卒中的重要工具。近几十年来，局灶性脑缺血动物模型的改良方法不断涌现，使我们能更好地了解局灶性脑缺血发生、发展的病理生理学机制[1]。局灶性脑缺血的动物模型可使用各种实验动物，如小鼠、大鼠、兔子、猫、狗、猪、羊、猴子等。用小鼠建立的局灶性脑缺血模型比用大型动物节省试剂及药物等成本，更加经济。几乎所有大型动物上观测的指标均可在用小鼠建立的模型上观测到，而且小鼠建立的模型具有种系同质性、纯合性好的优势。小鼠脑动脉环的组成和脑血管解剖特点更接近人类，因此小鼠是建立局灶性脑缺血的理想模型动物。小鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型是现在普遍应用的标准的局灶性脑缺血的动物模型。最常用的有线栓插入法、开颅手术电凝闭塞法、光化学诱导法、栓子栓塞法等建模方法[2-9]。本文就上述常用的小鼠局灶性脑缺血模型分别进行介绍。

1 线栓插入法

1986年Koizumi等[2]首先报道应用硅胶涂层的线栓构建大鼠局灶性脑缺血模型。1989年，Longa等[3]报道用火将线栓头端烧钝，再将线栓插入大鼠大脑中动脉，从而构建大鼠局灶性脑缺血模型，并创建了Longa评分用于评价大鼠神经功能的缺损。线栓插入法随后被广泛运用于建立大鼠及小鼠的局灶性脑缺血模型。1994年Huang等[10]用线栓插入法建立了小鼠局灶性脑缺血模型。1997年Hara等[11]用线栓插入法构建了改良的小鼠急性局灶性脑缺血模型，线栓阻断小鼠左侧大脑中动脉3 h再进行再灌注，使小鼠脑梗死体积减少约44%，提高了实验动物存活率。国内李冠华等[12]2009年报道应用线栓插入法制备大鼠局灶性脑缺血的模型，线栓阻断大鼠左侧大脑中动脉2 h再进行再灌注，24 h实验动物手术成活率约67%。赵军等[13]应用线栓插入法建立了小鼠脑缺血再灌注模型，对小鼠左侧大脑中动脉闭塞1 h后再灌注，发现脑缺血再灌注后，补体调节蛋白CD59的表达水平发生显著变化，其可能参与了脑缺血再灌注损伤的免疫损伤过程。Zuo等[14]于2012年报道，用石蜡涂层线栓构建大鼠大脑中动脉永久性闭塞模型，12 h内，大鼠手术成功率100%，而使用无石蜡涂层的线栓，大鼠手术成功率只有55%。使用石蜡涂层线栓建模获得了比普通尼龙线栓建模更大的脑梗死体积，而且动物死亡率降低，实验结果令人鼓舞。

近年来，国内构建小鼠局灶性脑缺血模型主要使用线栓插入法。线栓插入法构建的脑缺血模型，其建模效果与线栓的直径及线栓插入血管内的深度直接相关。改变线栓的直径、形状及插入深度，可选择性阻断大脑中动脉、后交通动脉、颈内动脉分支[15]。本模型不需开颅即可实现大脑中动脉缺血再灌注，可准确控制缺血再灌注时间，从而保持了硬脑膜的完整，减少了动物颅内感染的发生概率。术中肉眼直视即可完成线栓阻断大脑中动脉，不需使用手术显微镜，降低了建模成本。此模型可用于脑缺血再灌注损伤及神经元对缺血耐受性、敏感性的研究，还可用于溶栓药物治疗的研究。

但线栓插入法构建缺血性脑卒中模型存在以下缺点：术中线栓需要由颈内动脉插入至大脑中动脉近端，需要一定的手术技巧。术中盲插线栓的过程中可能因刺破血管，造成蛛网膜下腔出血或颅内血肿。Longa等[3]线栓插入法构建的动物模型，蛛网膜下腔出血率将近40%。在线栓阻断大脑中动脉的同时，可能会干扰或阻断同侧大脑前动脉、大脑后动脉的血流，造成大面积的脑梗死甚至发生大脑半球的脑梗死，术后脑梗死体积个体间差异较大，均一性较差，术后小鼠神经功能评分较差，小鼠术后死亡率也偏高[11]。线栓插入后，小鼠下丘脑体温调节中枢的血流受到影响，可能会导致术后小鼠体温紊乱，影响脑梗死的体积。

因此，使用线栓插入法构建小鼠局灶性脑缺血模型时应注意：线栓头端应该圆钝、光滑，不要形成弯钩或边刺。根据小鼠的体质量选择不同直径的线栓。线栓过软、过硬都会影响线栓顺利插入大脑中动脉。线栓在推进的过程中，可能会遇到阻力，此时强行推入可能导致血管破裂出血，小鼠围术期死亡率增高。线栓插入过深或插入时间过久，可使大脑中动脉全部闭塞，导致脑梗死面积过大，增加了小鼠术后死亡率，需严格控制线栓插入深度[16]。

2 开颅手术电凝闭塞法

Tamura等[4]于1981年率先报道了开颅手术电凝闭塞法构建大鼠缺血性脑卒中模型。术中直视下直接电凝阻断小鼠大脑中动脉，可以得到比盲插线栓阻断大脑中动脉更为稳定、连贯一致并且可重复的局灶性脑缺血体积。术者术中可以选择电凝阻断大脑中动脉的部位，小鼠术后脑梗死体积均一性好，梗死灶可靠，术后存活率高，存活时间长。而且直接手术电凝阻断大脑中动脉后的小鼠，术后神经功能评分普遍要好于线栓插入法的小鼠，其术后生存时间也长于线栓组小鼠，术后生存时间可达2周甚至更长。Yang等[17]于2013年报道采取氟烷吸入麻醉并监测小鼠生命体征的前提下，电凝小鼠左侧大脑中动脉同时行双侧颈内动脉阻断15 min的方法构建了无需排除及纳入标准的局灶性脑缺血模型。在小鼠缺血性脑卒中急性期及慢性期研究中，无实验动物死亡，手术操作需时短，脑梗死后小鼠死亡率低。此模型可用于评估小鼠局灶性缺血性脑卒中、远期神经功能，还可用于缺血性脑卒中、远期神经运动功能缺损康复的研究，是一种较理想的小鼠局灶性脑缺血的动物模型[18-20]。

开颅手术直接电凝闭塞小鼠大脑中动脉构建的模型的缺点：模型建立需要开颅手术，对术者的手术技巧要求较高，手术过程也较线栓插入法复杂，对手术器械设备的要求也比较高。手术显微镜、双极电凝、微血管夹等手术器械设备价格昂贵，不利于普及。手术时间的长短主要靠研究者自身手术技巧及手术的熟练程度。术中切开颞肌，分离颞肌周围的血管神经后，部分小鼠术后可发生颞肌受损，颞下颌关节紊乱，从而影响小鼠术后进食，严重进食困难的小鼠可因营养不良而死亡。由于小鼠颅骨较菲薄，术中微型磨钻钻小鼠颞骨时，可能会发生颞骨被磨钻钻透，直接损伤小鼠脑组织或损伤脑组织表面的血管而引发血管破裂出血。还可能因双极电凝与大脑中动脉粘连在一起，从而撕裂大脑中动脉或其穿支血管，或者在双极电凝大脑中动脉时，双极直接损伤到小鼠脑组织，造成医源性损害。术中肌肉或血管损伤造成的少量出血即可造成小鼠术后活动能力下降等虚弱表现。由于术中颅骨开放，硬脑膜打开，可以引起颅内压波动，增加了术后发生脑脊液漏、术区及伤口感染等并发症的风险。因此需进一步规范构建局灶性脑缺血动物模型的手术操作，使术者熟练掌握局灶性脑缺血动物模型构建技巧。在今后的研究中，尽量应用国产手术器械，以降低构建动物模型的成本。

另外，开颅手术电凝闭塞大脑中动脉的模型，电凝大脑中动脉的位置选择也很重要。Ma等[20]在小鼠大脑中动脉发出外侧纹状体动脉的远端进行电凝阻断，建立了较为稳定并且可以重复的局灶性脑缺血模型，此模型术后产生的脑梗死体积更大，小鼠术后神经功能评分更好。Liesz等[21]电凝小鼠大脑中动脉的位置在同侧外侧纹状体动脉的远端与大脑中动脉的皮质之间，这样构建的局灶性脑缺血模型的脑梗死体积较小。如果在小鼠同侧嗅束与大脑中动脉起始部之间电凝大脑中动脉，则可能会阻断供应同侧基底节区的穿支动脉，导致同侧基底节区出现明显脑梗死，从而导致小鼠术后神经功能评分受到影响，小鼠术后死亡率亦相应增高。

3 光化学诱导法及栓子栓塞法

光化学诱导法：其基本原理是静脉给予实验动物光敏剂，以特定冷光源照射实验动物头部，激发光化学反应，导致实验动物局部脑水肿和血小板微血栓产生，从而形成局灶性脑梗死[5-7]。1975年，Kovács等[5]首先报道了应用光化学法建立大鼠及小鼠的缺血性脑卒中模型。Kovács应用伊文斯蓝为光敏剂注入实验动物体内，再以氦氖气体激光对实验动物进行照射，从而形成实验动物脑梗死。2004年，Suqimori等[6]改良了光化学法，在分离小鼠颞肌，显露颞骨后，静脉给予小鼠玫瑰红溶液，再应用氪激光束照射小鼠大脑中动脉近端以形成局灶性脑缺血。使用光化学诱导法不需要开颅手术，术后实验动物存活率较高，但其易致脑表面微血管损伤及表浅动静脉闭塞、血脑屏障破坏，而且由于实验动物脑皮质的侧支循环丰富，所形成的脑缺血半暗带范围狭小，限制了其进一步的推广应用[7]。

栓子栓塞法：栓子来源可以采用自体血凝块或者自体血栓栓子、纤维蛋白栓子、聚乙烯微球、微粒碳球等[8-9]。Zhang等[8]于1997年报道了栓子栓塞法来构建小鼠局灶性脑缺血模型。Zhang等将纤维蛋白的栓子注入小鼠大脑中动脉起始部来模拟人类的栓子栓塞。2004年，Mayzel-Oreg等[9]由实验动物颈外动脉注入聚乙烯微球形成局灶性脑梗死，发现诱导脑梗死所需的时间要远远慢于大脑中动脉闭塞法。栓子栓塞法模型可在小鼠脑内多形成多发的梗死灶，所形成的脑梗死体积与栓子的直径及数量直接相关，适于进行抗栓或溶栓治疗的研究及脑梗死后远期神经功能康复的研究。此模型与人类脑栓死形成的机制类似，可用于模拟人类颅内多发栓塞及脂肪栓子栓塞。构建此模型手术创伤较小，成功率较高，但术者在术中较难判断小鼠脑血管内导管的确切位置，栓子注入后术者很难预见脑缺血的范围及脑梗死的具体部位。

4 建模应注意的问题

应用上述几种手术方式建模时均需注意以下几点：1)使用相同种系的动物(小鼠)建模。不同种系的动物(小鼠)对脑缺血的耐受程度不同，脑缺血后的梗死体积亦不相同，会造成选择性偏倚[2]。2)术中需注意监测小鼠平均动脉压、局部脑血流、体温等参数。这些参数的稳定是建模成功及可重复的基础。3)术中需控制麻醉深度，麻醉过浅，小鼠术中会发生躁动，顺从性不高。麻醉过深可导致小鼠术中呼吸抑制死亡或术后苏醒时间延长。4)术中保持小鼠体温于37℃左右，术后在小鼠未苏醒时注意保温。如果术后保温不良，小鼠容易发生术后体温过低，增加小鼠术后死亡的风险。5)手术后的小鼠需单独置入笼中，防止未苏醒或者意识模糊的小鼠被同类攻击[22]。6)尽量缩短手术操作时间。术者手术操作越熟练，操作时间越短，小鼠术后成活率越高。

应用线栓栓塞法、开颅手术闭电凝塞法、栓子栓塞法构建小鼠局灶性脑缺血模型还需注意，术中分离小鼠颈总动脉时勿牵拉、刺激或损伤迷走神经，勿损伤气管，否则可能会导致小鼠术中心跳骤停或影响小鼠术后的吞咽及呼吸功能。

5 结语

不同方法构建的小鼠局灶性脑缺血模型有各自的优点、缺点及适用范围。研究者可根据自己的实验目的、研究方向以及自己的实验条件来进行相应选择。构建小鼠局灶性脑缺血模型的技术越来越成熟，但仍存在众多问题亟待解决。进一步规范、优化小鼠局灶性脑缺血的建模方法，降低动物死亡率，建立能更好模拟人类局灶性脑缺血发病机制的动物模型仍是我们继续探索和努力的方向。我们已经应用开颅手术电凝闭塞大脑中动脉的方法成功构建了小鼠的缺血性脑卒中模型，小鼠术后脑梗死体积均一性好，梗死灶可靠，术后存活率高，存活时间长。我们准备继续完善此模型，并在此模型基础上开展硬脑膜动脉血管融通术治疗亚急性期脑梗死，观察神经保护药物在急慢性缺血性脑血管病治疗中的作用等研究。

1 Durukan A， Tatlisumak T. Acute ischemic stroke： overview of major experimental rodent models， pathophysiology， and therapy of focal cerebral ischemia［J］. Pharmacol Biochem Behav， 2007， 87（1）：179-197.

2 Koizumi J， Yoshida Y， Nakazawa T，et al. Experimental studies of ischemic brain edema：1.A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area［J］. Japanese Journal of Stroke， 1986， 8（1）： 1-8.

3 Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S，et al. Reversible midd le cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke，1989， 20（1）： 84-91.

4 Tamura A， Graham DI， Mcculloch J，et al. Focal cerebral ischaemia in the rat： 1. Description of technique and early neuropathological Consequences following middle cerebral artery occlusion［J］. J Cereb Blood Flow Metab， 1981， 1（1）： 53-60.

5 Kovács IB， Tigyi-Sebes A， Trombitás K，et al. Evans blue： an ideal energy-absorbing material to produce intravascular microinjury by HE-NE gas laser［J］. Microvasc Res， 1975， 10（1）： 107-124.

6 Sugimori H， Yao H， Ooboshi H，et al. Krypton laser-induced photothrombotic distal midd le cerebral artery occlusion without craniectomy in mice［J］. Brain Res Brain Res Protoc， 2004， 13（3）：189-196.

7 Hoff EI， Oude Egbrink MG， Heijnen VV，et al. In vivo visualization of vascular leakage in photochemically induced cortical infarction［J］. J Neurosci Methods， 2005， 141（1）： 135-141.

8 Zhang Z， Chopp M， Zhang RL，et al. A mouse model of embolic focal cerebral ischemia［J］. J Cereb Blood Flow Metab， 1997， 17（10）：1081-1088.

9 Mayzel-Oreg O， Omae T， Kazemi M，et al. Microsphere-induced embolic stroke： an MRI study［J］. Magn Reson Med， 2004， 51（6）：1232-1238.

10 Huang Z， Huang PL， Panahian N，et al. Effects of cerebral ischemia in mice deficient in neuronal nitric oxide synthase［J］. Science，1994， 265（5180）：1883-1885.

11 Hara H， Fink K， Endres M，et al. Attenuation of transient focal cerebral ischemic injury in transgenic mice expressing a mutant ICE inhibitory protein［J］. J Cereb Blood Flow Metab， 1997， 17（4）：370-375.

12 李冠华，冯泽国，周建平．PTD-BDNF对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用［J］.军医进修学院学报，2009，30（4）：522-524．

13 赵军，晏沐阳，张传福，等．CD59在小鼠脑缺血再灌注损伤中的表达及意义［J］.解放军医学院学报，2013，34（4）：373-375．

14 Zuo XL， Wu P， Ji AM. Nylon filament coated with paraffin for intraluminal permanent midd le cerebral artery occlusion in rats［J］. Neurosci Lett， 2012， 519（1）：42-46.

15 孙文昊，陈会生．啮齿类动物脑缺血模型的回顾与研究进展［J］.中国脑血管病杂志，2013，10（8）：432-435．

16 包新杰，赵浩，赵英杰，等．线栓法插线深度对大鼠脑梗死模型制备的影响［J］.中国实验动物学报，2011，19（3）：233-236．

17 Yang D， Naka jo Y， Iihara K， et a l. A log lip tin， a dipeptidylpeptidase-4 inhibitor， for patients with diabetes mellitus type 2， induces tolerance to focal cerebral ischemia in non-diabetic，normal mice［J］. Brain Res， 2013， 1517： 104-113.

18 Liu F， Mccullough LD. Middle cerebral artery occlusion model in rodents： methods and potential pitfalls［J/OL］. http://www.hindawi.com/journals/bmri/2011/464701

19 Kanemitsu H， Nakagomi T， Tamura A，et al. Differences in the extent of primary ischemic damage between midd le cerebral artery coagulation and intraluminal occlusion models［J］. J Cereb Blood Flow Metab， 2002， 22（10）： 1196-1204.

20 Ma J， Peng C， Guo W，et al. A modified model of middle cerebral artery electrocoagulation in mice［J］. CNS Neurosci Ther， 2012，18（9）： 796-798.

21 Liesz A， Hagmann S， Zschoche C，et al. The spectrum of systemic immune alterations after murine focal ischemia： immunodepression versus immunomodulation［J］. Stroke， 2009， 40（8）： 2849-2858.

22 甄毅岚，王亚男，李晟，等．线栓法制备不同体重KM小鼠局灶性脑缺血/再灌注模型的建立及评价［J］.中国实验动物学报，2013，21（2）：39-44．

Comparison and analysis of focal cerebral ischemia stroke model in mice

ZHAO Qiang1,2, ZHU Wei-jie1, WANG Fu-yu1, TONG Huai-yu1, XU Bai-nan1
1Department of Neurosurgery, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Department of Neurosurgery, Baoding No．1 Hospital, Baoding 071000, Hebei Province, China
Corresponding author: XU Bai-nan． Email: 1036601334@qq．com

Mouse focal cerebral ischem ia model is an important tool to study ischem ic cerebrovascular disease and it can help us understand the pathogenesis of focal cerebral ischemia better． Follow ing is a review of most commonly used focal cerebral ischem ia model: f lament occlusion, electrocoagulation occlusion, photochem ical induction method and embolization of the MCA in m ice．

model; mice; focal cerebral ischemia; brain infarction

R 651.1

A

2095-5227(2014)08-0870-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.08.026

2014-06-17 10:27

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140617.1027.001.html

2014-04-29

国家自然科学基金项目(81171109)；解放军总医院临床科研扶持基金(2012FC-TSYS-4016)；保定市科学技术研究与发展指导计划(10ZF014)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81171109)作者简介：赵强，男，在读博士，副主任医师。研究方向：缺血、出血性脑血管病。Email: zq7786@sina.com

许百男，男，博士，主任医师，教授，博士生导师。Email: 1036601334@qq.com