急性髓系白血病骨髓单个核细胞EphrinB2基因表达及其临床意义

刘清，杨静，闻向梅，林江，陈芹，钱军

（江苏大学附属人民医院1．血液科，2．中心实验室，江苏镇江212002）

急性髓系白血病骨髓单个核细胞EphrinB2基因表达及其临床意义

刘清1，杨静1，闻向梅2，林江2，陈芹2，钱军1

（江苏大学附属人民医院1．血液科，2．中心实验室，江苏镇江212002）

目的：探讨急性髓系白血病（acutemyeloid leukemia，AML）患者骨髓EphrinB2基因的表达情况并分析其临床意义。方法：应用实时定量PCR（real-time quantitative PCR，RQ-PCR）技术检测91例AML患者（观察组）及32例非恶性血液病患者（对照组）骨髓单个核细胞标本的EphrinB2表达水平。结果：AML患者中EphrinB2表达水平比对照组明显下调（P＜0．01）。EphrinB2表达水平与AML患者的性别、外周血白细胞计数、血小板计数、血红蛋白含量、FAB分型及核型分组之间均无相关性（P＞0．05），但低表达患者的年龄明显低于高表达患者（P＝0．011）。接收者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析表明，ROC曲线下面积0．812（95%CI：0．726～0．898；P＜0．01）及0．776（95%CI：0．670～0．883；P＜0．01）可分别用于区分AML患者与对照组及细胞遗传学正常的AML患者与对照组。EphrinB2低表达组患者与高表达组患者的化疗后完全缓解率及总生存时间差异均无统计学意义（P＞0．05）。结论：EphrinB2表达下调是AML患者中的一个常见分子事件，但对患者预后并无明显影响。

EphrinB2；急性髓系白血病；表达

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia， AML）是髓系祖细胞在发育过程中受阻于分化成熟的某一定阶段，使克隆性白血病细胞因增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他组织和器官，同时导致正常造血受抑制。AML发病涉及多个基因的突变、缺失、重复、易位等，基因组异常在其发生发展中起着重要作用。因此，寻找更多与AML发生发展相关的异常分子是目前临床与基础研究的一个重要方向。我们应用实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR，RQ-PCR）方法测定32例非恶性血液病患者和91例AML患者骨髓单个核细胞中EphrinB2的表达水平，以了解EphrinB2在AML中的临床意义。

1 材料和方法

1．1 病例

91例AML病例为2005年5月至2014年3月在江苏大学附属人民医院住院治疗的患者，其中男48例，女43例，年龄15～87岁（中位55岁），诊断分型按FAB和WHO 2008版标准［1－2］。治疗方案参照以前的报道［3］。患者主要的临床表现和实验室特征如表1。对照组32例中，3例为特发性血小板紫癜，29例为缺铁性贫血。

1．2 细胞系及细胞培养

7种人白血病细胞株分别为SHI-1、THP-l、HL-60、HEL、NB4、U937和K562。细胞培养的方法：以1×106／mL的密度置于细胞培养瓶中，加入5 mL含10%胎牛血清的IMDM培养液，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养。

1．3 骨髓单个核细胞（BMMNC）分离、RNA提取和反转录

骨髓穿刺时抽取骨髓10 mL，肝素抗凝，使用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞。应用Trizol一步法提取总RNA，经紫外分光光度仪测定RNA浓度及纯度［D（260 nm）／D（280 nm）比值1．8～2．0］，－80℃保存备用。2．0μg总RNA经随机引物反转录合成第1链cDNA，总体系40μL，其中含25 U RNA酶抑制剂（RNAsin）、10 mmol／L还原剂（DTT）、0．5 mmol／L dNTPs、200 U反转录酶（MMLV，美国MBI Fermentas公司）；反转录反应为25℃10 min、42℃60 min，cDNA储存于－20℃备用。

1．4 RQ-PCR检测EphrinB2的表达量

应用Primer Premier 5．0软件设计引物，EphrinB2引物序列上游：5′-TCTTTGGAGGGCCTGGATAA-3′，下游：5′-CGTCTGTGCTAGAACCTGGATT-3′，扩增片段长度208 bp；内参为ABL管家基因，其上游引物为5′-TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA-3′，下游引物为5′-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。25μL PCR反应体系中含1×缓冲液2．5 mmol／L、dNTP 0．5 mmol／L、MgCl24．0 mmol／L、荧光染料（20×EvaGreen）1．2μL、上下游引物1．0μmol／L、荧光定量PCR参比染料（50×Rox）0．8μmol／L、cDNA 50 ng和DNA聚合酶（Taq DNA Polymerase，MBIFermentas，USA）1．0 U。反应在ABI 7300扩增仪（ABI公司）上进行，扩增条件为94℃预变性4 min、94℃变性30 s、66℃退火30 s、72℃延伸30 s、82℃收集荧光30 s，共40个循环，熔解曲线程序为95℃15 s、60℃60 s、95℃15 s、60℃15 s。每次扩增均以重组EphrinB2质粒为阳性对照，以双蒸水作为无模板对照（NTC）。熔解曲线揭示PCR产物为单一峰，2%琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物长度，结果显示正确。随机选取2例PCR产物进行测序证实序列正确。

1．5 阳性模板与标准曲线的制备

将1例AML患者的ABL及EphrinB2表达的定性PCR扩增产物克隆进入PGEM-T载体，扩增后进行纯化回收，连接过夜后重组载体，提取质粒，测序鉴定（上海生工生物工程公司）完全正确，分别将其定量；从108拷贝／μL开始进行10倍稀释，建立阳性模板梯度后分别进行RQ-PCR扩增，绘制阳模标准曲线。选取EphrinB2与ABL表达ΔCT值最小的1例对照标本作为对照。EphrinB2基因表达采用如下公 式：；PCR扩增效率E＝10（－1／斜率）；ΔCT指对照与标本之间EphrinB2和ABL循环阈值（CT）的差异。

1．6 统计学分析

应用SPSS 17．0软件包进行统计学处理。连续性变量之间的差异分析使用Mann-Whitney U检验（两组比较）或Kruskal-Wallis（多组间比较），分类变量之间的差异比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；EphrinB2表达与临床资料之间的相关性分析采用Spearman秩和检验；生存时间与生存分析采用Kaplan-Meier法；EphrinB2表达在AML中的诊断价值采用接收者操作特征曲线（ROC）及曲线下面积（AUC）进行评价；P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 AML患者和各细胞系中EphrinB2的表达

EphrinB2在7个白血病细胞系中均存在阳性表达（0．001～1．421），在HL-60和HEL细胞系中EphrinB2转录本表达阳性率较高。EphrinB2在AML患者、7个白血病细胞系及正常对照组中的表达水平，RQ-PCR产物的典型凝胶电泳结果见图1。EphrinB2在AML中的表达（0～1．725，中位数为0．020）明显低于对照组（0～7．131，中位数为0．194，P＜0．01）。见图2。

2．2 EphrinB2表达的诊断意义

采用ROC曲线评估EphrinB2表达是否可以作为潜在的AML诊断标志，结果显示EphrinB2表达水平能有效鉴别AML和对照组，ROC曲线下面积为0．812（95%CI：0．726～0．898，P＜0．01）。以0．054为临界值，通过EphrinB2诊断AML的灵敏度和特异性分别为71．7%和75．8%。此外，ROC曲线显示EphrinB2表达水平同样能够有效区分正常核型AML患者和对照组（AUC＝0．776，95%CI：0．670～0．883，P＜0．01）。见图3。

2．3 AML的临床和实验室特点

以相对定量0．054为界值，将32例对照组标本和91例AML标本分成低表达组和高表达组。对照组中低表达阳性率为18．8%（6／32），AML标本低表达组阳性率为72．5%（66／91），两组间差异有统计学意义（χ2＝28．21，P＜0．01）。使用该临界值对EphrinB2表达水平进行分组统计，结果显示EphrinB2表达水平与AML患者的性别、外周血白细胞计数、血小板计数及血红蛋白含量之间均无相关性（P＞0．05），但低表达患者的年龄明显低于高表达患者（P＝0．011）；在FAB分型中，EphrinB2表达频率依次为M4（60．0%，12／20）、M5（66．7%，4／6）、M2（75．6%，31／41）、M3（76．5%，13／17）、M1（85．7%，6／7），各组间差异无统计学意义（χ2＝31．27，P＝0．666）；不同核型分组之间EphrinB2表达无明显差异且不同核型AML患者间EphrinB2转录本表达也无明显差异（表1）。

2．4 EphrinB2表达与AML患者预后之间的关系

EphrinB2低表达组患者化疗后完全缓解（complete remission，CR）率稍高于高表达组患者（分别为48%和39%），但差异并无统计学意义（χ2＝0．555，P＞0．05）。除去M3的患者，74例患者具有随访资料，EphrinB2高表达的总体生存时间较EphrinB2低表达患者短（中位数分别为6个月和7个月），但差异并无统计学意义（P＞0．05）。此外，除去M3后的细胞遗传学正常的AML患者EphrinB2高表达的总体生存时间较EphrinB2低表达患者的短（中位数分别为8个月和11个月），但差异也无统计学意义（P＞0．05）。见图4。

3 讨论

EphrinB是酪氨酸激酶超家族受体Eph的配体中的一员。EphrinB2基因定位于人类13号染色体q33，在许多恶性肿瘤中呈高表达，且与肿瘤血管的生成密切相关，在恶性肿瘤的生长和转移中起着重要作用［4］。近年来的研究表明，EphrinB2在多种实体肿瘤中表达上调，包括肝癌［5］、胶质瘤［6］、鼻咽癌［7］、非小细胞肺癌［8］、头颈部鳞癌［9］、宫颈癌［10］、子宫内膜癌［11］、卡波氏肉瘤［12］、卵巢癌［13］等，但在血液系统恶性疾病中研究甚少。Pennisi等［14］发现多发性骨髓瘤患者的间充质干细胞及溶骨性病变处的骨细胞中EphrinB2表达明显下调、EphrinB2-Fc抗体可促进血管新生但并不影响骨髓瘤生长。Kuang等［15］则发现部分急性淋巴细胞白血病（ALL）原代细胞或细胞株中存在EphrinB2表达降低，与启动子过甲基化密切相关。我们的结果表明AML患者中同样存在着EphrinB2表达下降，提示EphrinB2表达改变在实体瘤和造血系统肿瘤中可能发挥着不同的作用。

鉴定具有诊断、辅助诊断、预后判断和分层治疗指导价值的新标志一直是肿瘤临床研究的一个重要方向。我们通过ROC曲线发现EphrinB2表达水平检测对于区分AML和对照具有良好的灵敏度和特异性，为AML患者尤其是正常核型AML患者提供了鉴别诊断和疾病随访的分子标志。此外，我们的结果没有发现EphrinB2表达下调与除了年龄之外的其他指标之间的相关性。

既往的研究发现胶质瘤［6］、头颈部鳞癌［9］、宫颈癌［10］、子宫内膜癌［11］和卵巢癌［13］患者中EphrinB2过表达者预后不良。目前关于造血肿瘤中EphrinB2表达异常的临床研究甚少，Kuang等［15］发现Eph和Ephrin基因家族中发生甲基化的基因数量与ALL患者的生存时间呈负相关。但我们的初步结果并未发现EphrinB2表达水平对AML患者的治疗反应和预后具有判断价值。当然，需要更多的病例以及前瞻性临床试验来进一步明确EphrinB2表达对预后的影响。

综上所述，我们的结果显示EphrinB2表达下调是AML患者中的一个常见分子事件，但对患者的预后并无明显影响；检测EphrinB2表达可用于AML患者的辅助诊断。

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Expression of EphrinB2 gene and its clinical significance in acutem yeloid leukem ia

LIU Qing1，YANG Jing1，WEN Xiang-mei2，LIN Jiang2，CHEN Qin2，QIAN Jun1
（1．Department of Hematology，2．Laboratory Center，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To investigate the expression of EphrinB2 gene and analyze its clinical significance in acute myeloid leukemia（AML）．M ethods：Real-time quantitative PCR（RQ-PCR）technique was used to examine EphrinB2 expression level in the bonemarrow mononuclear cells from 91 AML patients and 32 non-malignant hematologic patients．Results：EphrinB2 level in AML patients was significantly down-regulated compared to controls（P＜0．01）．There was no correlation between the level of EphrinB2 transcript and the sex，blood parameters，FAB subtypes and cytogenetic risks（P＞0．05），but the age of low expressed patientswas significantly lower than those high expressed patients（P＝0．011）．Receiver operating characteristic curve（ROC）analysis revealed that an areas under the ROC curve of 0．812（95% CI：0．726－0．898；P＜0．01）or 0．776（95%CI：0．670－0．883，P＜0．01）in discriminating AML patients or cytogenetically normal AML patients from controls，respectively．There was no significant difference in the rate of complete remission and overall survival between the groupswith low and high EphrinB2 expression（P＞0．05）．Conclusion：Decreased EphrinB2 expression is a common molecular event in cases with AML but has no impact on the prognosis of patients．

EphrinB2；acutemyeloid leukemia；expression

R733．71

A

1671－7783（2014）05－0389－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140209

国家自然科学基金资助项目（81270630，81172592）；江苏省临床医学科技专项基金资助项目（BL2012056）；江苏省“333工程”科研项目资助计划（BRA2011085，BRA2013136）；镇江市医学重点人才、镇江市社会发展项目（SH2013042，SH2013082）；江苏大学临床医学科技发展基金资助项目（JLY20120013，JLY20120011）

刘清（1986—），女，硕士研究生；钱军（通讯作者），主任医师，硕士生导师，E-mail：qianjun0007＠sina．com

2014－07－15 ［编辑］ 陈海林