红景天苷对百草枯中毒大鼠肺组织保护作用的研究

郑兰芝 张卓一 黄小民 徐俪颖 陆如凤 周晶晶 丁黎敏

●论 著

红景天苷对百草枯中毒大鼠肺组织保护作用的研究

郑兰芝 张卓一 黄小民 徐俪颖 陆如凤 周晶晶 丁黎敏

目的 通过观察红景天苷对百草枯中毒大鼠肺组织转化生长因子-β1（TGF-β1）表达、TNF-α含量和血清IL-6水平的影响，探索其对肺损伤的保护作用。方法将90只SD大鼠随机分为正常对照组、百草枯模型组、红景天苷治疗组，后两组再分为1、6、24、72h 4个亚组，每组10只。百草枯模型组和红景天苷治疗组采用百草枯溶液1ml/kg一次性灌胃制备急性百草枯中毒肺损伤模型，然后分别予等容积的0．9%氯化钠溶液、红景天苷1ml/kg腹腔注射。3组大鼠麻醉后，取股动脉血测定IL-6水平，处死后取肺组织，观察病理变化，采用免疫组化和RT-PCR测定肺组织中TGF-β1及其mRNA的表达情况，并测定肺组织中TNF-α含量。结果百草枯模型组大鼠肺组织出现大片出血及坏死，红景天苷治疗组大鼠肺组织损伤程度较百草枯模型组减轻。与正常对照组比较，百草枯模型组、红景天苷治疗组肺组织6、24、72h TGF-β1表达显著增加(均P＜0．01)，但红景天苷治疗组较百草枯模型组为低(均P＜0．05)。百草枯模型组与红景天苷治疗组中毒后第1h起大鼠肺组织TGF-β1mRNA水平开始增加，但红景天苷治疗组较百草枯模型组为低（均P＜0．05）。与正常对照组比较，百草枯模型组及红景天苷治疗组肺组织中TNF-α含量、血清IL-6水平从第6h开始显著增加(均P＜0．01)，但红景天苷治疗组在各时点均较百草枯模型组为低(均P＜0．05)。结论TGF-β1参与了百草枯中毒大鼠肺损伤的早期病理生理过程，红景天苷能抑制TGF-β1的表达，降低肺组织TNF-α含量、血清IL-6水平，从而减轻百草枯对大鼠肺组织的损伤。

红景天苷 百草枯中毒 急性肺损伤 转化生长因子-β1

百草枯是一种高效季胺类除草剂，有触杀和传导性作用，其除草效果好且价格便宜，可以增加工作效率。百草枯接触泥土后，能迅速分解失效，毒性降低，因而是一种对土壤没有伤害的除草剂，但如经消化道和呼吸道直接吸收进入人体，则对人体伤害极大，其中以急性肺损伤最为显著，可波及多器官系统[1-2]。随着百草枯广泛应用，百草枯中毒发生率逐渐增加，已经是一个世界性的公共卫生问题，在亚洲地区尤为突出，统计显示，有机磷农药中毒是最主要的中毒性疾病，其中百草枯中毒病死率最高，病死率＞50%[3-4]。百草枯中毒的高病死率除了与其本身的高毒性有关，还与其缺乏有效的治疗手段有关。目前临床上仍以对症治疗及血液净化治疗为主，暂无有效、理想的治疗手段。因此寻找一种有效治疗百草枯中毒的方法甚为迫切。红景天苷是从藏药红景天分离的一种苯乙醇类化合物，是红景天的主要有效成分，具有抗炎、抗缺氧、抗肿瘤、抗衰老及抗肝纤维化等作用，对大鼠烧伤继发的肺损伤和肺功能障碍具有明显治疗作用[5-9]。本研究前期实验证实[10]，红景天苷对百草枯中毒大鼠急性肺损伤Toll样受体4（TLR4）和核转录因子-κB（NF-κB）mRNA表达水平具有抑制作用，能保护百草枯中毒大鼠引起的急性肺损伤。在此基础上，笔者进一步观察百草枯中毒大鼠肺组织转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA表达水平，以及肺组织TNF-α含量和血清IL-6水平，探讨红景天苷对百草枯中毒大鼠急性肺损伤的保护作用及机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠90只，体重190～210g，清洁级；由浙江中医药大学实验动物中心提供，并在清洁级环境下采用标准颗粒饲料和标准饮用水按常规饲养。动物生产许可证号：SCXK（z）2008-0022，动物使用许可证号：SYXK（z）2008-0115，并通过伦理审批。百草枯为山东三元工贸有限公司产品，批号：GB19308-2003，浓度20%；红景天苷为中国药品生物制品检定所产品，批号：CY90076，纯度＞98%；TGF-β1试剂盒为美国Invitrogen公司产品，免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司。逆转录试剂盒由日本TaKaRa公司提供。TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒均为中国深圳NeoBioscience公司产品。多功能真彩色细胞图像分析管理系统为美国Media Cybernetics公司Image-Pro Plus。

1.2 动物分组和模型制备 将实验大鼠随机分为3组：（1）正常对照组10只；（2）百草枯模型组 40只（再分为4个亚组，分别为百草枯中毒后1、6、24、72h组，各10只）；（3）红景天苷治疗组40只（再分为4个亚组，分别为红景天苷治疗后1、6、24、72h组，各10只）。采用一次性灌胃百草枯溶液制备急性百草枯中毒肺损伤模型，灌胃剂量：百草枯（20%百草枯原液稀释10倍）1ml/kg灌胃，红景天苷治疗组予等量百草枯灌胃；正常对照组予等容积的0.9%氯化钠溶液灌胃。红景天苷治疗组在百草枯灌胃中毒后即刻予腹腔注射红景天苷（采用纯红景天苷干粉稀释至1%浓度）1ml/kg，每隔12h腹腔注射1次。百草枯模型组及正常对照组予腹腔注射相同剂量的0.9%氯化钠溶液，每隔12h腹腔注射1次。

1.3 方法

1.3.1 标本采集与检测 正常对照组在1h后予10%水合氯醛0.4ml/100g麻醉，股动脉取血后处死大鼠；百草枯模型组和红景天苷治疗组分别在中毒后1、6、24、72h予10%水合氯醛0.4ml/100g麻醉，股动脉取血后处死大鼠；3组大鼠均取右中上肺组织。分离血清，将肺组织于-70℃冰箱中保存待测。

1.3.2 肺组织病理检测结果 将肺组织用4%甲醛固定，石蜡包埋，行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肺组织病理学变化。

1.3.3 肺组织中TGF-β1的表达 采用免疫组化法测定。取大鼠肺组织0.5cm×0.5cm×0.1cm组织块进行固定、包埋、切片及染色等处理，利用显微镜观察，随机选取5个视野，采用计算机图像处理软件测定各组肺组织TGF-β1含量，以免疫组织化学染色阳性单位表示，阳性细胞数分级分为：0～1%、1%～10%、10%～50%、50%～80%、80%～100%，分别计为0、1、2、3和4分；阳性细胞显色强度分为阴性、弱阳性、阳性和强阳性，分别计为0、1、2和3分，免疫组化评分（IHS）=阳性细胞数分级×阳性细胞显色强度分级。

1.3.4 肺组织中TGF-β1mRNA的表达 采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测。用Trizol一步法抽提肺组织总RNA，根据引物设计原理和在PUBMED数据库中查找待检测基因的DNA、mRNA及内参GAPDH序列，采用引物设计软件Primer Premier5.0设计上游和下游引物，引物序列详见表1。采用20μl体系反转录制备CDNA，反应体系为0.4 μl、PCR Reverse Primer（10μmol/L）0.4 μl、ROX 0.4 μl、DNA模板2.0 μl、dH2O（灭菌蒸馏水）、6.8 μl，退火温度60℃30s进行定量RT-PCR检测。

表1 荧光实时定量PCR反应各个基因特异性引物

1.3.5 肺组织中TNF-α含量测定 取大鼠肺组织约0.5g，加入1ml预冷的0.9%氯化钠溶液研磨匀浆，离心后取上清液，按试剂盒的说明书进行操作。

1.3.6 血清中IL-6水平测定 常规分离获得血清，按试剂盒的说明书进行操作。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，各组间数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，计数资料组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 大鼠百草枯中毒表现 大鼠中毒后 0.5h即开始出现精神不佳，进食、进水量减少，萎靡、眯眼、拱背、反应迟钝、呼吸加快，6h后出现口唇紫绀、张口呼吸，甚至呼吸窘迫等，24～72 d症状进行性加重，呼吸系统最为明显，伴随体重下降、腹泻及血尿等；红景天苷治疗组大鼠上述中毒表现有所减轻。百草枯模型组大鼠死亡12只（30.0%），红景天苷治疗组大鼠死亡5只（12.5%），两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 肺组织病理改变 HE染色显示正常对照组大鼠肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡内未见水肿液，肺间质无炎性细胞浸润（图1A，见插页）。百草枯模型组1h出现明显毛细血管扩张、充血等肺泡炎症表现（图1B，见插页），6h后肺泡间隔明显增宽，肺泡腔内充满渗出的水肿液，部分有透明膜形成（图1C，见插页），24～72h肺组织炎症、渗出明显，伴有出血、坏死及炎性细胞浸润，细支气管黏膜上皮损伤部分脱落,肺泡壁上大量炎症细胞浸润，可见肺泡结构萎陷，肺不张、肺气肿（图1D、E，见插页）。红景天苷治疗组各时点肺组织病理改变与百草枯模型组相似，但病变程度相对较轻（图1F～I，见插页）。

2.3 各组大鼠肺组织TGF-β1的表达 与正常对照组比较，第6h起百草枯模型组的肺组织TGF-β1表达阳性细胞计数及免疫组化评分显著增加（P＜0.01），在第72h达到最大值，红景天苷治疗6、24、72h组TGF-β1表达阳性细胞计数及免疫组化评分增加下降，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表2、3。

表2 各组大鼠肺组织TGF-β1表达阳性细胞计数的比较（%）

表3 各组大鼠肺组织TGF-β1表达免疫组化评分的比较（分）

2.4 各组大鼠肺组织TGF-β1 mRNA表达的比较 结果表明，大鼠中毒后1h开始肺组织中TGF-β1 mRNA表达量开始增加，随着时间发展，TGF-β1 mRNA表达量逐渐增加，而红景天苷治疗组大鼠肺组织中TGF-β1 mRNA表达量改变相对较小，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表4。

表4 各组大鼠肺组织TGF-β1 mRNA表达的比较

2.5 各组大鼠肺组织中TNF-α含量的比较 与正常对照组相比较，从第6h起百草枯模型组及红景天苷治疗组的肺组织匀浆中TNF-α含量显著增加（P＜0.01），并且随着时间的延长而不断提高，在第72h达到最大值；红景天苷治疗组中TNF-α含量增加较百草枯模型组相对较少，与百草枯模型组的差异有统计学意义（P＜0.05），详见表5。

表5 各组大鼠肺组织中TNF-α含量的比较（pg/ml）

2.6 各组大鼠血清中IL-6水平的比较 与正常对照组比较，从第6h起百草枯模型组和红景天苷治疗组大鼠血清中的IL-6水平有显著增加（P＜0.01），并随着时间的延长而不断增加；红景天苷治疗组中IL-6水平增加相对较少，与百草枯模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05），详见表6。

表6 各组大鼠血清中IL-6水平的比较（pg/ml）

3 讨论

百草枯口服吸收后，由于肺组织存在聚胺类物质摄取系统，百草枯能够逆浓度梯度在肺组织中聚集，约为血浆浓度的6～10倍[11]，肺组织损伤最为突出，而且肺组织的百草枯清除速度比其他组织的清除速度明显慢。早期肺组织损伤以肺泡上皮损伤，出血性水肿，炎症细胞浸润为主，晚期则出现肺泡内及间质纤维化[12]。本实验证实百草枯中毒后1h，肺组织病理切片HE染色即发现毛细血管扩张、充血，6h后肺泡腔内充满渗出的水肿液，部分有透明膜形成等肺泡炎症表现，24～72h肺组织炎症、渗出明显，部分有出血、坏死，细支气管黏膜上皮损伤部分脱落，肺泡壁上大量炎症细胞浸润，可见肺泡结构萎陷，肺不张，红景天苷治疗组各时点肺组织病理改变与百草枯模型组相似，但病变程度相对较轻。

近年来肺损伤、肺纤维化发病机制的研究进展发现，多种细胞因子如TGF-β1、TNF-α、IL-6等参与了肺损伤、纤维化的发生、发展，其中TGF-β1作为一个关键的多肽类生长因子，具有调节细胞生长、分化、凋亡等不同的生物活性，在急性肺损伤、肺纤维化发生的过程中，通过趋化巨噬细胞和成纤维细胞，诱导相关炎症细胞释放，促进炎症反应发生；TGF-β1还可通过上调细胞外基质（ECM）表达，增加肺内ECM沉积；促进成纤维细胞对胶原及纤维结合蛋白的合成，参与肺损伤、肺纤维化形成[13]；此外，还可以通过影响其他致纤因子如血小板衍生因子（PDGF）、TNF-α加速肺损伤、肺纤维化形成[14]。TGF-β被公认为肺损伤、纤维化形成与发展的启动枢纽。百草枯中毒可通过多种途径引起细胞因子发生变化，有研究表明其中TNF-α和IL-6与ALI/ARDS关系最为密切[15]。TNF-α主要由活化的单核/巨噬细胞和T淋巴细胞产生，在炎症反应中具有始动和关键的促炎免疫作用。IL-6由T细胞、B细胞、单核细胞、成纤维细胞及内皮细胞等多种细胞产生，主要功能是诱导B细胞生长、分化并产生免疫球蛋白，形成免疫复合物，造成肺损伤。红景天是景天科草本植物，多分布于高寒地带，《四部医典》提及红景天“性平，味涩，善润肺、补肾、理气养血”，现代药理学研究证实，红景天提取物具有抗衰老，增强免疫，减少炎症细胞浸润保护心肌[10]、抗氧化及中枢神经系统的双向调节作用[16]。红景天苷是红景天的主要有效成分，既往研究表明，红景天苷通过抑制肺组织中炎症介质及抗氧化作用可以改善脂多糖和油酸所致急性肺损伤[9]，红景天苷亦可以通过抑制博莱霉素致大鼠肺纤维化模型肺组织的MMP-2、TIMP-1的合成及分泌，在一定程度上调整其比值使其趋于平衡，减轻博莱霉素所致大鼠的肺损伤[17]。本研究结果表明，红景天苷治疗中毒大鼠后，免疫组化显示肺组织TGF-β1上升幅度有所下降，阳性细胞数及TGF-β1基因表达量相对较小，差异有统计学意义，说明红景天苷能够减轻百草枯中毒大鼠肺损伤的程度。红景天苷作用机制较为复杂，从多种途径参与百草枯中毒肺损伤保护，而其中作用机制之一可能通过降低TGF-β1的表达而发挥作用。红景天苷治疗组肺组织TNF-α含量及血清IL-6水平于中毒后各时间点较百草枯模型组均有显著降低，差异有统计学意义，提示红景天苷能减轻百草枯中毒大鼠肺脏的炎症损伤，可为临床治疗提供依据。

百草枯中毒治疗为临床治疗难题，而本研究发现TGF-β1、TNF-α和IL-6参与了百草枯中毒后肺损伤的病理生理过程，红景天苷能够有效抑制TGF-β1的表达，降低肺组织中TNF-α含量及血清IL-6水平，从而减轻百草枯中毒后大鼠肺组织的损伤程度，延缓肺纤维化的进程，本实验进一步阐明了红景天苷治疗百草枯中毒肺损伤的可能机制，为临床治疗百草枯中毒提供了理论基础。

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Protective effect of salidroside on paraquat poisoned rat lung tissue and its mechanism

Objective To investigate the effect of salidroside(SDS)on paraquat poisoned rat lung tissue and its mechanism．MethodsNinety Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into normal control group (n=10),paraquat model group(n=40)and SDS treatment group(n=40)．Rats in model and treatment groups were administered with a single dose of PQ (1ml/kg)by gavage;then 1ml/kg salidroside (treatment group)or 0．9%saline(model group)was injected intraperitoneally．The rats in model and treatment groups were sacrificed at 1,6,24 and 72h after treatment(10 in a batch),the blood samples were taken from femoral arterial and the lung tissue samples were also collected．The serum IL-6 levels were measured,and the pathological changes in lung tissue were examined;the expression of TGF-β protein and mRNA were detected by immunohistochemistry and RT-PCR,respectively;the TNF-a levels in lung tissue were also measured．ResultsSevere hemorrhage and necrosis were noticed pathologically in lung tissue of model group,the degree of lung injury in treated group was attenuated compared with model group．Compared with normal control group,the expression on TGF-β1 in lung issue of both model and treatment groups at 6,24,72h increased significantly (all P＜0．01),but the expression in treatment group was lower than that in model group(P＜0．05)．The TGF-β1mRNA level in lung tissue of model and treatment groups began to increase at 1h after poisoning,but the level in treatment group was lower than that in model group (P＜0．05)．Compared with normal control group,lung tissue TNF-a levels and serum IL-6 levels of model and treatment groups began to increase from 6h after poisoning (P＜0．01), but those in treatment group were lower at each time points (all P＜0．05)．ConclusionSalidroside can attenuate the lung tissue injury induced by paraquat in rats,which is associated with down-regulation of TGF-β1,TNF-a expression in lung tissue and decreased serum IL-6 levels．

Salidroside Paraquat poisoning Acute lung injury Transforming growth factor-β1

2014-03-17）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省中医药科技计划（2013ZA056）；浙江省医药卫生科技计划（2013KYA141）

310006 杭州，浙江中医药大学附属第一医院急诊科

张卓一，E-mail：zhangzhuoyi701213@163.com