Snail、Slug在喉鳞状细胞癌中表达与上皮-间质转化及侵袭转移之间的关系

平金良 顾栋桦 徐炜 顾元忻 张靖华 宋鹏涛 方炜 刘进 戴利成

Snail、Slug在喉鳞状细胞癌中表达与上皮-间质转化及侵袭转移之间的关系

平金良 顾栋桦 徐炜 顾元忻 张靖华 宋鹏涛 方炜 刘进 戴利成

目的 研究Snail、Slug基因在喉鳞状细胞癌中的表达，探讨其与肿瘤上皮-间质转化及侵袭转移之间的关系及临床意义。方法 采用免疫组化EnVision法检测74例喉鳞状细胞癌组织及30例癌旁组织中Snail、Slug及Vimentin、E-cadherin的表达情况，统计分析其表达的相关性及与各临床病理指标之间的关系。结果 Snail、Slug蛋白在喉鳞状细胞癌组织中的阳性率为58．2%和55．4%，高于癌旁组织中阳性率（13．3%和16．7%，P＜0．05）。Snail、Slug蛋白表达与E-cadherin呈负相关性（r=-0．567，P＜0．001及r=-0．457，P＜0．001），与Vimentin的表达呈正相关性（r=0．453，P＜0．001及r=0．376，P＜0．001）。Snai、Slug蛋白表达与分化程度、TNM分期及淋巴结转移密切相关（均P＜0．05）。结论 转录因子Snail、Slug可能通过参与与调控EMT过程，与喉鳞状细胞癌的发展和侵袭相关。

SnailSlug 上皮-间质转化 喉肿瘤 鳞状细胞癌

侵袭与转移是恶性肿瘤最本质特征之一，也是临床肿瘤治疗失败和死亡的主要原因。肿瘤的侵袭、转移受多基因、多因素、多步骤控制的极其复杂的过程。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是多细胞生物胚胎发生过程中的基本过程，在肿瘤发生、浸润和转移进展过程中扮演重要角色，成为近年肿瘤研究的热点之一[1]。研究表明转录因子Snail、Slug参与了EMT的发生，促使肿瘤的侵袭与转移[2]。喉鳞状细胞癌是头颈部常见的一种恶性肿瘤，且近年有上升趋势，严重威胁人类的健康。本文通过检测喉鳞状细胞癌中Snail、Slug的表达，探讨其介导EMT在喉鳞状细胞癌浸润、转移中的作用及意义。

1 资料和方法

1.1 临床资料 收集湖州市中心医院2005-01—2010-12资料完整的74例喉癌根治手术标本，其中男61例，女13例；年龄43～88岁，平均63.68岁，中位年龄64岁；根据国际抗癌联盟（UICC）TNM分期标准（2010版），Ⅰ～Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期48例；分化程度：高、中分化55例，低分化19例；肿瘤甲状软骨受累20例，未累及54例；淋巴结转移25例，无淋巴结转移49例；患者术前均未接受过放疗和化疗。同时选取30例癌旁黏膜上皮组织（距肿瘤外缘距离＞2cm）作为对照组。样本组织均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。

1.2 主要试剂 兔抗人多克隆Snail、Slug抗体购自美国Santa Cruz公司，Vimentin和E-cadherin单克隆抗体及EnVision免疫组化试剂盒购自丹麦DAKO公司，4℃冰箱保存备用。

1.3 免疫组织化学染色 免疫组织化学采用EnVision二步法，按产品说明书操作。操作步骤简述如下：组织切片经脱蜡、脱二甲苯、水化后，0.3%H2O2封闭内源性过氧化物酶15min，柠檬酸钠缓冲液（0.01mol/L，pH6.0）微波抗原修复10min，冷却至常温，滴加一抗（Snail、Slug工作浓度1∶100，Vimentin和E-cadherin工作浓度1∶200），37℃孵育40min，滴加酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30min，滴加二氨基联苯胺（3，3＇-diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精复染细胞核，常规脱水，透明，封片，光镜下观察。以PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。

1.4 结果判定 免疫组化染色结果由2位高年资病理医师采用双盲法阅片进行判定。Snail、Slug蛋白以细胞质或细胞核内出现棕黄或棕红色颗粒为阳性表达，染色结果综合染色强度及阳性细胞数进行分析，染色强度积分分值（IRS）=SI×PP。SI表示染色强度：无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；PP表示阳性细胞数百分比：无阳性细胞为0分，＜10%为1分，10%～50%为2分，＞50%为3分，积分分值（IRS）0～2分为阴性，3～9分为阳性。

图1 喉鳞癌细胞中snail表达阳性，细胞核及细胞浆呈现棕黄色颗粒（Envision法，×100）

图2 喉鳞癌细胞中slug表达阳性，细胞核及细胞浆呈现棕黄色颗粒（Envision法，×200）

Vimentin以细胞质内出现黄色颗粒为阳性表达，≤20%为阴性，＞20%为阳性。E-cadherin免疫组化结果判读：染色后随机选取10个400倍高倍视野，以细胞膜呈明显棕红色圈状染色为阳性，阳性细胞数≥50%判为E-cadherin正常表达，＜50%为E-cadherin表达减弱[3]。1.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件分析，计量资料比较采用t检验，Snail、Slug、Vimentin和E-cadherin表达及与喉鳞状细胞癌临床病理关系分析选择χ2检验，各基因蛋白表达间的关系分析采用Spearman相关分析。

2 结果

2.1 Snail、Slug蛋白在喉鳞状细胞癌、癌旁组织中的表达 Snail在阳性表达位于细胞质和（或）细胞核，喉鳞状细胞癌组织43例呈阳性表达（阳性率58.2%）（图1），癌旁组织4例阳性表达（阳性率13.3%），两者的差异有统计学意义（χ2=14.816，P＜0.01）。Slug阳性表达定位于细胞质和（或）细胞核，在喉鳞状细胞癌组织41例阳性表达（阳性率55.4%，图2），癌旁组织的5例阳性表达（阳性率16.7%），两者差异有统计学意义（χ2=12.986，P＜0.01）。

2.2 E-cadherin及Vimentin蛋白在喉鳞状细胞癌、癌旁组织中的表达 E-cadherin阳性信号均匀分布于细胞连接处的细胞膜上，清晰沟画出细胞轮廓（图3）。喉鳞状细胞癌中，39例样本肿瘤细胞的E-cadherin表达下降（占52.7%），35例表达正常水平（占47.3%），30例癌旁黏膜上皮组织E-cadherin均正常表达（100%），鳞癌细胞中E-cadherin表达明显低于癌旁黏膜（χ2= 25.297，P＜0.01）。Vimentin阳性表达主要定位于细胞浆（图4），26例喉鳞状细胞癌组织呈阳性表达（占35.1%），而癌旁组织未见阳性表达，两者差异有统计学意义（χ2= 14.054，P＜0.01）。

2.3 Snail、Slug及Vimentin、E-cadherin喉鳞状细胞癌中表达的相关性 经Spearman相关分析，喉鳞状细胞癌中Snail、Slug与E-cadherin蛋白表达呈负相关（r=-0.567，P＜0.01及r=-0.457，P＜0.01），与Vimentin蛋白表达呈正相关（r=0.453，P＜0.01及r=0.376，P＜0.01）。Snail与Slug在喉鳞状细胞癌中表达呈正相关（r=0.616，P＜0.01）。

图3 喉鳞癌中E-cadherin表达下降，局部高分化癌细胞呈正常表达（Envision法，×200）

图4 喉鳞癌中vimentin表达阳性（Envision法，×400）

2.4 Snail、Slug表达与喉鳞状细胞癌临床病理关系 见表1。

表1 Snail和Slug的表达与喉鳞癌临床病理的关系

由表1可见，Snail与Slug蛋白表达与肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移均密切相关（均P＜0.05），Snail与Slug表达阳性组病例的分化程度更差，表现更高的淋巴结转移率及更高的TNM分期。

3 讨论

EMT是上皮细胞在特定生理和病理情况下向间充质细胞转化的现象，是具有极性的上皮细胞黏附性下降和细胞移动能力增加，重塑细胞骨架的过程。其中E-cadherin功能丧失被认为是EMT发生的一个标志性事件。E-cadherin是细胞间黏附分子，主要介导同种细胞间的黏附反应，是维护上皮细胞形态和结构完整性和极性的重要分子。在EMT过程中的重要特征之一是细胞的表型发生改变，上皮细胞标志的E-cadherin逐渐下降、丧失，间质标志Vimentin表达上调，使癌细胞的获得浸润和转移能力在肿瘤的侵袭和远处转移中起重要作用[4]。

Snail和Slug是锌指转录因子snail家族中的主要成员，在生物的胚胎发育及生命活动中发挥重要的作用，研究表明snail家族成员是上皮-间质转化过程中的重要调控因子。Snail和Slug可以和E-cadherin基因启动区的E-box结合，抑制靶蛋白表达[2]。

本研究结果显示74例喉鳞状细胞癌中39例E-cadherin表达下降，26例Vimentin呈阳性表达，提示在部分喉鳞状细胞癌中可能发生了上皮-间质转化现象。进一步分析发现，Snail、Slug表达与E-cadherin呈负相关性，与Vimentin阳性呈正相关，提示Snail、Slug参与或诱导了喉鳞状细胞癌EMT的发生。本研究显示在癌旁组织中Snail、Slug很少表达，而在喉鳞癌中的表达明显增加，并且Snail、Slug表达均与淋巴结转移和甲状软骨侵犯密切相关，并且预示更差的组织学分级以及临床TNM分期。张华东等[5]的研究也发现喉鳞状细胞癌组织中Snail的表达发生上调，并且与患者的预后密切相关，与本文的结果相一致；虽然许多实验证明了Slug在肿瘤EMT过程中非常重要[6-7]，但其在喉鳞癌中的研究较少报道，本研究结果提示Slug同样促进喉鳞癌的EMT，并且使肿瘤获得了更强的侵袭和转移能力。

综上，本文结果表明在喉鳞状细胞癌中存在上皮-间质转化的现象，Snail、Slug在喉鳞癌的发生、发展过程中发挥一定作用，可以对临床预后的判断和分子生物治疗有潜在价值。

[1]Tsai J H,Yang J．Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis[J]．Genes Dev,2013,27(20):2192-206．

[2]Lamouille S,Xu J,Derynck R．Molecular mechanisms of epithelialmesenchymal transition[J]．Nat Rev Mol Cell Biol,2014,15(3):178-196．

[3]邬万新,张燕萍,温晓伟,等．乳腺癌上皮间质转化与基底细胞样表型的关系[J]．中华病理学杂志,2009,38(8):519-523

[4]Gheldof A,Berx G．Cadherins and epithelial-to-mesenchymal transition[J]．Prog Mol Biol Transl Sci,2013,116:317-336．

[5] 张华东,熊正文,黄勇,等．Snail蛋白在喉鳞癌组织中的表达及临床意义[J]．山东医药,2011,51(27):56-57

[6]Shih J Y,Yang P C．The EMT regulator slug and lung carcinogenesis[J]．Carcinogenesis,2011,32(9):1299-1304．

[7]Naber H P,Drabsch Y,Snaar-Jagalska B E,et al．Snail and Slug, key regulators of TGF-β-induced EMT,are sufficient for the induction of single-cell invasion[J]．Biochem Biophys Res Commun,2013,435(1):58-63．

Expression of snail and slug in laryngeal squamous carcinoma and its relation to epithelial-mesenchymal transition,tumor invasion and

metastasis

Objective To investigate the expression of snail and slug in laryngeal squamous carcinoma and its relation to epithelial-mesenchymal transition(EMT),tumor invasion and metastasis．Methods The expression of snail,slug,E-cadherin and vimentin was detected by immunihistochemistry in 74 specimens of laryngeal squamous carcinoma and 30 specimens of pericancerous mucosal tissue． Results The positive rates of snail and slug expression in laryngeal squamous carcinoma were 58．2%and 55．4%respectively,which were significantly higher than those in pericancerous mucosal tissue(13．3%and 16．7%,P＜0．05)．The expression of snail and slug were negatively correlated with E-cadherin(r=-0．567,P＜0．001 and r=-0．457,P＜0．001) and positively corrected with vimentin(r=0．453,P＜0．001 and r=0．376,P＜0．001)in laryngeal squamous carcinoma．The expression of snail and slug was closely correlated with pathological grade,TNM stage,thyroid cartilage involvement and lymph node metastasis of laryngeal squamous carcinoma．Conclusion Snail and slug are highly expressed in squamous laryngeal carcinoma;it may be involved in epithelial-mesenchymal transition,invasion and metastasis of the tumor．

SnailSlug Epithelial-mesenchymal transition Largneal tumorSquamous carcinoma

2014-09-18）

（本文编辑：田云鹏）

湖州市科技计划项目（2012YSB19，2013GYB11）

313000 湖州市中心医院病理科（平金良、顾栋桦、徐炜、顾元忻、宋鹏涛、方炜、刘进），头颈外科（张靖华），中心实验室（戴利成）

平金良，E-mail:pjl0173@163.com