星点设计-效应面法优化枇杷叶三萜酸提取工艺研究

柯仲成, 胡善庆, 方 超, 朱志平, 徐志远

（黄山学院化学化工学院制药工程教研室, 安徽 黄山 245041）

星点设计-效应面法优化枇杷叶三萜酸提取工艺研究

柯仲成, 胡善庆, 方 超, 朱志平, 徐志远

（黄山学院化学化工学院制药工程教研室, 安徽 黄山 245041）

目的 星点设计-效应面法优化枇杷叶中三萜酸的提取工艺。 方法 以乙醇体积分数、 料液比和提取时间为自变量，三萜酸得率为因变量，通过自变量与因变量的二次响应面的回归拟合，优化提取工艺并进行预测分析。结果最佳提取工艺为 14.4 倍量 82%乙醇， 提取 2 次， 每次 155 min。 结论 星点设计-效应面法优选枇杷叶三萜酸的提取工艺，方法简便，精度高，预测性优。

枇杷叶、星点设计、三萜酸、提取工艺

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷 Eriobotrya japonica Lind 的干燥叶，为传统中草药，性寒味苦，具有止咳平喘，清肺和胃，降气化痰的功效，其主要成分有三萜酸类、黄酮类、挥发油、多酚类等。其中三萜酸类成分主要有熊果酸、齐墩果酸、科罗索酸和山楂酸等，这些成分具有明显的降血糖［1-2］、 抑制肺纤维化［3-4］和抗肿瘤［5-6］等药理活性。

近年来，在中药材提取工艺优化上，主要有正交设计法和星点设计-效应面优化法两种方法， 也能获得较好的工艺参数。相对而言，正交设计的应用更久、更为广泛，但星点设计作为一种相对较新的方法，随着研究的逐渐深入，在中药提取等相关领域的应用也迅速增加。目前，已有正交设计考察枇杷叶总三萜酸提取工艺的研究报道［7-8］， 尚未见采用星点设计—效应面法优化枇杷叶三萜酸的提取工艺研究。 本实验采用星点设计-效应面法［9-12］优化提取工艺参数，并与文献报道的正交设计结果进行比较，以期能获得较高的枇杷叶三萜酸得率，以便能在药品、保健品等领域有更好的开发应用。

1 仪器与试药

KQ-100VDE型双频数控超声波清洗器 （ 昆山超声）; T6 新世纪紫外可见分光光度计 （北京普析）;GZX—MBE数显鼓风干燥箱 （上海博讯）;AUY220 分析天平 （日本岛津）。

熊果酸对照品 （上海融禾医药科技有限公司，批号110106）; 枇杷叶 （2013 年 5 月采自安徽歙县漳潭）; 其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 三萜酸测定方法的建立

2.1.1 熊果酸标准溶液的配制 精密称取 4.7mg熊果酸对照品， 用甲醇溶解， 转移至 100 mL量瓶中， 甲醇稀释至刻度， 定容， 即得质量浓度为 47 μg/mL的熊果酸标准溶液。

2.1.2 样品溶液的配制 称取 10 g枇杷叶， 粗碎， 置于500 mL圆底烧瓶中， 乙醇回流提取， 合并滤液， 减压回收至无醇味，石油醚脱脂，再用水饱和正丁醇萃取，浓缩，减压干燥， 得枇杷叶提取物。 精密称定 10 mg， 用适量甲醇溶解， 并转移至25 mL量瓶中， 定容， 备用。

2.1.3 标准曲线的绘制 精密移取质量浓度为 47 μg/mL熊果酸标准溶液 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2 mL， 分别置于 6 个蒸发皿中， 80 ℃水浴挥干， 加 5%香草醛-冰醋酸0.4 mL， 加高氯酸 0.8 mL， 60 ℃水浴加热 15 min， 冰浴冷却后， 加冰醋酸 5.0 mL， 摇匀， 于 545 nm处测定吸光度［13］， 以进样质量为横坐标， 吸光度为纵坐标， 绘制标准曲线。 所得的回归方程为 Y=0.013 9X+0.133 3， r= 0.999 1， 表明样品在 9.4 ～47.0μg范围内线性关系良好。

2.1.4 加样回收率试验 精密移取 2.0 mL样液 6 份， 分别加入质量浓度为 9.4 μg/mL熊果酸标准溶液 1.0、 2.0、3.0 mL（各 2 份）， 按 “2.1.3” 项方法操作并测定吸光度， 计算得加样回收率为 100.3%。

2.2 枇杷叶三萜酸提取工艺优化

2.2.1 实验设计及结果 参考文献 ［14-15］ 并结合预试验可知，影响回流提取枇杷叶三萜酸的主要因素有:乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取次数等。由于提取次数不是一个连续变量因素， 不易处理［16］， 故先将其固定为2。在效应面设计思路的指导下，设置乙醇体积分数、 料液比和提取时间等3个因素，并将每因素设置3个水平，分别用代码值 -1.682、 0、 1.682 来表示。 代码值所代表的实际操作值见表 1， 试验设计及相关结果见表 2。

表1 各因素与水平的代码值与实际值对照

表2 星点设计及试验结果

2.2.2 数学模型拟合 利用 Design-Expert 7.1.3 软件， 将试验数据进行效应面分析， 以枇杷叶中三萜酸得率 （Y）为效应值， 分别对 X1、 X2、 X3三个因素， 分别进行二项式方程和多元线性方程拟合，发现利用二项式方程拟合较优，得方程如下:

考虑其中有些为 t检验不显著项， 将其删除， 得到二项式方程简化式:

从表3中方差分析可知，除乙醇体积分数、液料比、提取时间等3个因素各自对枇杷叶三萜酸得率有极显著影响 （P＜0.01）， 料液比和提取时间的相互作用也对枇杷叶三萜酸得率有显著的相互影响 （P＜0.05）。 而乙醇体积分数与料液比、乙醇体积分数与提取时间则无显著的相互影响 （P＞ 0.05）。 因此， 该方程能比较准确地阐述枇杷叶三萜酸随各个因素的变化趋势，具有很好的预测指导性。

2.2.3 提 取工艺优化 和预测 利 用软件 （ Design-Expert 7.1.3）， 按照二项式方程的数学模型， 绘制枇杷叶三萜酸得率 （Y） 与 X2、 X3等 2 个变量的三维效应曲面图及等高曲线， 见图1。

利用此数学模型， 可以预测在最优提取工艺 （14.38倍量的81.89%乙醇， 提取2 次， 每次2.59 h） 条件下， 回流提取枇杷叶三萜酸， 得率最大值为 3.45%。

表3 方差分析

2.2.4 验证试验 以预测的最优提取条件为基础， 基于方便操作的原则， 将工艺条件微调为14.4 倍量82%乙醇， 提取 2 次， 每次 155 min， 进行 3 次平行验证试验， 测定并计算枇杷叶三萜酸得率分别为 3.38%、 3.35%、 3.42%， 平均值为 3.38%， RSD为 3.5%。 说明所建立的数学模型具有可靠的预测性，所选工艺条件具有较高的重现性。

3 讨论

虽然三萜酸具有降血脂、降血糖和抗肿瘤等作用，在枇杷叶中含有量较高，但对其提取工艺研究却较少，且大部分都为利用正交原理筛选工艺参数。 根据参考文献 ［8］的最佳提取工艺 （以 6 倍量和 4 倍量的 80%乙醇提取两次， 1.5 h/次）， 进行了提取试验， 通过测定发现三萜酸平均得率为 3.16%， 稍低于本研究优化的 3.38%， 有少许的差别 （RSD=6.96%）， 所以本研究的工艺参数虽可以获得稍高的三萜酸得率，但在提取溶剂方面消耗较大。因而这两种工艺参数各有优点，应根据生产实际需要，选择合适的提取条件。

图 1 X2X3相互作用对 Y的三维效应面和二维等高线曲线图

一般而言， 采用非线性数学模型星点设计-效应面法，充分考虑各个因素之间的相互影响，可以提高预测性和准确性，是被一些科研工作者认为优于正交设计的原因所在，其实并不尽然，其实正交设计如果在预试验的基础上，设置合理的因素与水平，同样也一定可以获得很好的工艺参数和较优的提取效果。

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R284.2

:B

1001-1528（2014）12-2618-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.041

2013-08-17

安徽省高校省级自然科学研究重点项目 （KJ2014A242）; 国家级大学生创新训练计划项目 （201210375034）; 安徽省自然科学基金项目 （1308085QH139）

柯仲成 （1981—）， 讲师， 研究方向: 中药新剂型。 E-mail:xiaoke1020@126.com