菌根真菌对人工栽培滇重楼重金属元素的影响

周 浓, 张德伟, 郭冬琴, 丁 博, 张德全, 王 雪

（1.大理学院 药学院, 云南 大理 671000； 2.重庆三峡学院 生命科学与工程学院, 重庆 404000； 3.重庆市万州食品药品检验所 中药室, 重庆 404000）

菌根真菌对人工栽培滇重楼重金属元素的影响

周 浓1,2, 张德伟3, 郭冬琴2, 丁 博2, 张德全1*, 王 雪1

（1.大理学院 药学院, 云南 大理 671000； 2.重庆三峡学院 生命科学与工程学院, 重庆 404000； 3.重庆市万州食品药品检验所 中药室, 重庆 404000）

目的 比较接种和不接种丛枝菌根真菌对滇重楼根茎中重金属元素铅、镉、砷、铜、汞的影响。方法 通过室温盆栽接种试验方法， 采用微波消解-原子吸收光谱法测定并比较收获滇重楼根茎中重金属的差异。 结果 不同丛枝菌根真菌对滇重楼根茎中重金属量的影响存在差异。接种丛枝菌根真菌能部分地降低其根茎中重金属含有量，所测量值均低于 《药用植物及制剂进出口绿色行业标准 （WM2-2001）》 和 《中国药典》 2010 年版相应的重金属限量标准。结论 人工接种丛枝菌根真菌可保证滇重楼临床用药的安全性。

滇重楼; 丛枝菌根真菌; 微波消解-原子吸收光谱法; 重金属

滇 重楼为百合 科 重 楼属植物云南重楼 Paris polyphylla Smith var.yunnanensis（ Franch.） Hara的干燥根茎， 现已列为二级濒危药用植物［1］。 由于滇重楼生长条件独特、生长周期长，加上产区药农过度采挖， 导致滇重楼野生资源濒临灭绝［2］。 滇重楼人工栽培已成为解决市场需求，实现野生资源可持续利用的唯一途径［3］。 滇重楼具有典型的重楼型丛枝菌根 （ AM），显示出较强依赖性［4］。 前期研究表明，采用AM真菌诱导子预处理后，没有改变滇重楼根茎的化学背景，但能部分提高其根茎中化 学 成 分 的 量［5］。 丛 枝 菌 根 真 菌 （ arbuscular mycorrhizal fungi，AMF） 侵染药用植物根系形成共生体过程中，通过参与药用植物生理生化代谢过程与基因调控，既能促进药用植物生长与发育，又能改善其根际微生态环境、促进宿主植物对矿质营养元素 （ 重金属） 的吸收［6-9］。有 资料表 明， 当 土壤溶液中重金属元素浓度较低的情况下，丛枝菌根真菌侵染能有效地促进根系对重金属元素的吸收，同时不同种类的中药材对不同重金属元素表现出吸附特异性［9-12］。随着我国对中药的认识不断发展， 重金属是目前公认的对人体有害微量元素，重金属残留和污染严重影响了中药的内在质量，其问题已对中药产业可持续发 展构成了严重威胁［13］。 为此，本实验采用原子吸收光谱法对不同AMF处理滇重楼中重金属元素进行分析，从重金属角度评估采用AMF提高滇重楼人工栽培品的质量安全性提供科学依据。

1 仪器与材料

丛枝菌根真菌来自北京市农林科学院植物营养与资源研究所国家基金资助 “丛枝菌根真菌种质资源库 （ BGC）”: 根 内球囊 霉 Clomus intraradices（ 编号 BGCAH01）、 聚丛球囊霉 Clomus aggregatum（ 编号 BGC HK02D）、 象牙白球囊霉 Clomus eburneum （编号 BGC HK02C）、 摩西球囊霉 Clomusmosseae（编号 BGC YN05）、 地表球囊霉 Clomus Versiforme（ 编号 BGCGD01C） 、幼套球囊霉 Clomusetunicatum （ 编号 BGC GZ03C）、扭形球 囊霉 Clomus tortuosum （ 编 号 BGC NM03A）、 沾屑多样 孢 囊霉Diversispora spurcum （编号 BGC SD03A）， 以上菌剂为沙土混合物，内含供试菌种孢子、侵染根段和菌丝片段;“根友”牌阿密蔻菌根由上海弘升科技发展有限公司惠赠;以不接种丛枝菌根真菌组为空白组 （CK组）; 滇重楼根茎取自大理市花甸坝药材场的同一批样品，并由大理学院药学院周浓副教授鉴定 为百合科 植 物 云南重楼 Paris polyphylla var. yunnanensis的根茎。 供试土壤购自大理市花鸟市场的林下腐殖土与当地砂壤土按照3∶1比例混合，风干过筛， 在 121 ℃高压湿热灭菌 2 h。 2010 年 2月14日采用室温盆栽方法， 生长期间按常规管理，定期浇水、 护理。 2010 年 12 月 12 日收获滇重楼植株的根茎， 清洗， 45 ℃烘干， 按分析要求分别粉碎过筛 （40 目）， 备用。

铅、镉、铜、汞、砷标准溶液，购自国家标准物质研究中心， 质量浓度均为 1 mg/mL; 实验用水为超纯水;试剂均为优级纯。

ML204 型分析天平 （梅特勒-托利多仪器上海有限公司）;Multiwave 3000 型微波消解仪 （ 奥地利安东帕中国有限公司）;AA-6300C型原子吸收分光光度计 （岛津企业管理中国有限公司）; 铅、镉、铜空心阴极灯，汞、 砷无极放电灯 （珀金埃尔默仪器上海有限公司）。

2 方法与结果

2.1 测定条件 采用石墨炉原子吸收法测定 Pb、Cd、 As，采用火焰原子吸收法测定 Cu， 采用氢化物-冷原子吸收法测定 Hg［14］。测定波长: 铅 283.3 nm， 镉 228.8 nm， 砷 193.7 nm， 铜 324.7 nm， 汞253.7 nm。 狭缝: 铅、 铜、 汞均为 0.5 nm， 镉 0.6 nm， 砷0.7 nm。测量模式: 峰面积法。

2.2 样品溶液的制备 样品的前处理和转移参照文献 ［15］， 分别精密称取样品 0.5 g， 置四氟乙烯微波消解罐中，加硝酸5 m L混匀。 置微波消解炉内进行消解 （第 1 步室温 经 3 min 升至温度100 ℃， 保持 2 min， 第 2 步 100 ℃经 5min 升至温度 180 ℃， 保持 15 min）。 消解完毕后冷却至室温，取出内罐将消解液转移并定容到10 mL量瓶中， 摇匀，即得供试品溶液。同法随行制备空白对照溶液。

2.3 标准曲线的绘制 分别精密量吸取 Pb、 Cd、As、 Cu 和 Hg的对照品贮备液按 《中国药典》 制备标准曲线［16］。按 “2.1” 项下测定条件测定吸收度， 以吸收度 （A） 为纵坐标、 质量浓度 （C） 为横坐标绘制标准曲线。 Pb、 Cd、 As、 Cu、 Hg的回归方程分别为:A=0.006 040C+0.038 300 （r=0.997 7）; A=0.070 195C+0.027 730 （r=0.996 9）;A= 0.011 926C+0.058 910（r=0.999 3）;A=0.179 060C+ 0.001 406（r=0.999 0）;A=0.007 363C+0.003 020（r=0.999 9）。 线 性范围 分别为 0 ～100 μg/m L、0 ～10 μg/mL、0 ～40 μg/mL、 0 ～80 μg/mL、0 ～40 μg/mL。

2.4 精密度试验 取上述 Pb、 Cd、 As、 Cu、 Hg同一标准溶液 （10 μg/mL）， 按 “2.1” 项下测定条件进行连续测定6次，测得各元素的吸收度，RSD分别为 1.7%、 0.3%、 1.4%、 1.0%、 2.1%。表明仪器的精密度良好。

2.5 重复性试验 取同一滇重楼样品 6 份 （CK组）， 按 “2.2” 项下方法制备样品溶液及 “2.1”项下测定条件进行测定，测得各元素的吸收度，Pb、 Cd、 As、 Cu、 Hg的 RSD 分 别 为 1.1%、2.7%、 2.6%、 2.3%、 3.0%。 表明本方法重复性良好。

2.6 稳定性试验 取同一滇重楼样品溶液 （CK组）， 室温密闭放置， 按 “2.1” 项下测定条件进行测定， 在0 ～24 h 内每隔 4 h 测定 1 次， 测得各元 素 的 吸 收 度， RSD 分 别 为 1.1%、 1.3%、0.3%、1.0%、 0.9%。 表明样品溶液在室温下放置24 h各元素的量基本不变。

2.7 检出限试验 在 “2.1” 项下测定条件对同法同时制备试剂的空白溶液进行连续测定11次， 其检测结果的3倍标准偏差除以标准曲线斜率作为本方法各元素的检出限。 Pb、 Cd、 As、 Cu、 Hg的检出限分 别 为 0.023 6、 0.001 1、 0.052 8、 0.009 4、 0.025 2 mg/kg， 结果符合痕量测定的要求。

2.8 加样回收率试验 精密称取同一滇重楼样品0.25 g（CK组），共 6 份，分别精密加入 Pb、 Cd、As、 Cu、 Hg标准溶液适量， 按 “2.2” 项下方法制备样品溶液及 “2.1” 项下测定条件进行测定，测定各元素的吸收度，计算回收率。结果表明，本方法回收率良好，符合分析要求， 结果见表1。

表 1 加样回收率试验结果 （n=6）Tab.1 Results of the recovery tests（n=6）

2.9 样品测定 按 “2.2” 项下方法制备样品溶液及 “2.1”项下测定条件进行测定， 结果见表2。

表 2 接种丛枝菌根真菌对滇重楼根茎重金属的影响 （mg/kg）Tab.2 Effect of AM fungi inoculated on contents of heavy metals in rhizome of P.polyphylla var.Yunnanensis（ mg/kg）

药材安全性评价标准参照中华人民共和国对外贸易绿色行业标准 《药用植物及制剂进出口绿色行业标准 （ WM2-2001）》 中药材重金属含量限值规 定［17］: 重 金 属 总 量 ≤ 20.0 mg/kg， As≤ 2.0 mg/kg， Hg≤0.2 mg/kg， Cd ≤0.3 mg/kg， Pb ≤5.0 mg/kg， Cu≤20.0 mg/kg。 结果表明， 不同接种丛枝菌根真菌人工栽培后，重金属残留程度不同，但均未超过上述标准的限量值，药材是安全的。

由表2可知，重金属残留量在不同丛枝菌根真菌处理组与CK组之间差别并不明显，部分丛枝菌根真菌处理组中重金属元素残留量超过CK组，可能与其滇重楼遗传差异性、吸附能力大小以及丛枝菌根真菌对同一种重金属的吸附特性等［11-12，18-19］有关，是否具有一定的富集能力，有待采集更多样本进一步研究其代谢规律，以达到增效减毒的目的。

中药材的重金属污染，常具有一定的隐蔽性，土壤中的重金属经药用植物吸收后通过食物链进入人体， 进而危害人体健康［20］。 目前对接种丛枝菌根真菌处理药用植物的研究多为生长发育及其无机元素吸收等方面，尤其是与药用植物产量和品质相关的研究，而对接种丛枝菌根真菌处理后根茎等地下部分重金属含有量的关注较少。研究接种丛枝菌根真菌处理后地下部分重金属污染特征，可为丛枝菌根真菌提高栽培药用植物产量及质量、稳定药效与药源提供理论依据。

3 结论

采用微波消解-原子吸收光谱法控制滇重楼人工栽培品中 Pb、 Cd、As、 Cu、 Hg等重金属的量，保证了药材使用的安全性。结果表明，接种丛枝菌根真菌后的滇重楼中重金属残留量有差异，但均远低于国家及行业标准中重金属的允许量。从重金属污染这个角度来说，采用丛枝菌根真菌处理的滇重楼及其衍生产品是安全的，为滇重楼人工栽培方法的选择提供了理论依据和试验数据。

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Effect of the arbuscular mycorrhiza fungi on heavy metals in Paris polyphylla var.yunnanensis by artificial cultivation

ZHOU Nong1，2， ZHANG De-wei3， GUO Dong-qin2， DING Bo2， ZHANG De-quan1*， WANG Xue1

AIM To compare effect of the arbuscular mycorrhiza（ AM） fungus inoculation and non-inoculation on contents of heavymetals Pb， Cd， As， Cu and Hg in rhizome of Parispolyphylla var.yunnanensis.METHODS By pot experiment at room temperature， contents of heavy metals in rhizome of P.polyphylla var.yunnanensis were determined and compared using the atomic absorption spectrometry after microwave digestion.RESULTS There was difference among various AM fungi on contents of heavy metals in the rhizome.Inoculated treatment of AM fungi could partly reduce contents of heavymetals in rhizome of P.polyphylla var.yunnanensis，and themeasured valueswere lower than the corresponding limit standards in the Creen Trade Standards of Importing&Exporting Medicinal Plants&Preparations（ WM2-2001） and the Chinese Pharmacopoeia （2010 version）. CONCLUSION AM fungi by artificial inoculation could ensure the safety ofmedication of P.polyphylla var. yunnanensis clinically.

Paris polyphylla var.yunnanensis;arbuscularmycorrhiza（AM） fungus;atomic absorption spectrometry aftermicrowave digestion;heavy metal

R284.1

:A

1001-1528（2014）12-2583-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.031

2013-11-27

云南省应用基础研究计划资助 （2011FB081）; 国家自然科学基金项目 （81260622）; 云南省教育厅科学研究基金重点项目（2012Z119）

周 浓 （1978—）， 男， 硕士， 副教授， 研究方 向: 药 用植物 栽培 与质量 控制。 Tel: （023） 58102522， E-mail:erhaizn@ 126.com

*通信作者: 张德全 （1980 —） ， 男， 博士， 讲师， 研究方向: 药用植物学。 Tel: （0872） 2257411， E-mail:zhangdeq2008@126.com

（1.College of Pharmacy， Dali University， Dali 671000， China;2.College of Life Science and Engineering， Chongqing Three Corges University，Chongqing 404000， China;3.Chongqing Wanzhou Institute for Food and Drug Control， Chongqing 40400， China）