LC-MS/MS法同时测定滇龙胆中 4 种苯甲酸酯类成分

潘 俊, 潘 聿, 肖 丹, 李志敏, 王元忠, 李晚谊*

（1.云南省农业科学院药用植物研究所, 云南 昆明 650205； 2.云南中医学院, 云南 昆明 650500）

LC-MS/MS法同时测定滇龙胆中 4 种苯甲酸酯类成分

潘 俊1, 潘 聿2, 肖 丹1, 李志敏1, 王元忠1, 李晚谊1*

（1.云南省农业科学院药用植物研究所, 云南 昆明 650205； 2.云南中医学院, 云南 昆明 650500）

目的 建立 LC-MS/MS 法同时测定滇龙胆中抗老年痴呆的 4 种主要成分 gentiside A， gentiside J， gentiside B， gentiside K的 量。 方 法 使 用 岛 津 LC-MS/MS 8030 液 质 联 用 仪， 色 谱 柱 为 Shim-pack XR-ODS Ⅲ （ 75 mm ×2.0 mm，1.6 μm）; 流动相为甲醇-0.1%甲酸， 等度洗脱; 离子源为电喷雾电离源 （ ESI）， 采用负离子多反应监测模式。 结果Gentiside A， gentiside J， gentiside B， gentiside K分 别 在 39.0 ～444.4 μg/mL、 39.0 ～444.4 μg/mL、 59.0 ～444.4μg/mL、 26.0 ～444.4 μg/mL范围内线性关系良好， 相关系数为 0.998 9 ～0.999 6; 所测的滇龙胆根部中， 4 种苯甲酸酯类成分的含有量分 别为 0.284、 0.358、 0.654、 0.267 mg/g; 加样 回收率为 98.1% ～ 102.6%， RSD为 0.7% ～1.7%。 结论 该方法专属性好、 精密度高， 可用于滇龙胆中苯甲酸酯类成分的检测。

滇龙胆; 老年痴呆; 苯甲酸酯;LC-MS/MS

滇龙胆 Centiana rigescens Franch.， 别名为滇龙胆草 （滇南本草）、 坚龙胆 （中国高等植物图鉴）、小秦艽 （云南）， 是 《中国药典》 2010 年版收录的龙胆品种之一，也是云南著名道地药材，具有清热燥湿，泻肝胆火的功效。主要活性成分为环烯醚萜苷类化合物，以龙胆苦苷为代表;该类物质具有保肝、健胃、镇痛、抗病毒、促进细胞分裂、加快伤口愈合等多种 功效［1-4］。 近期研究发现，滇龙胆提取物中有一系列新颖结构的苯甲酸酯类化合物，具有显著的类似神经生长因子活性，神经营养作用和保护作用，是一种高效低毒的抗老年痴呆症中药活性组分［5-6］。

目前文献报道多集中于龙胆中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷等的高 效液相色谱测定［7-8］， 而 对于龙 胆中苯甲酸酯类化合物的测定未见报道。 液相色谱-串联质谱 （LC-MS/MS） 联用技术具有高灵敏度、专属性好、快速、高效的特点，已逐渐成为中药微量成分定量分析的有效手段［9-11］。 本实验 建立了 LCMS/MS 对滇龙胆中 4 种苯甲酸酯类成分 gentiside A， gentiside J， gentiside B， gentiside K的 测 定 方法，为滇龙胆质量控制提供了强有力的保证和依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-MS/MS 8030 超高效液相三重四级杆串联质谱联用仪 （日本岛津公司）， 旋转蒸发仪R-215 （ 瑞 士 BÜCHI公 司）， 电 子 天 平 AL204-IC（ 梅特勒-托利多仪器有限公司）， Drict-Q5 超纯水机 （ 法 国 Millipo公 司 ），HS-1026OD 超 声 波 清洗器。

1.2 材料 对照品 gentiside A， gentiside B， gentiside J， gentisideK由浙江大学药学院提供; 滇龙胆样品采自云南，由云南省农业科学院药用植物研究所提供。甲醇、甲酸为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 测定条件

2.1.1 液相色谱条件 Shim-pack XR-ODS Ⅲ色谱柱 （75 mm×2.0 mm， 1.6 μm）; 流动相为甲醇-0.1%甲酸 （95 ∶5）， 等度洗脱， 平衡时间为6 min。 柱温 40 ℃; 体积流量 0.45 mL/min; 进样量 20 μL。

2.1.2 质谱条件 电喷雾电离源 （ESI）， 负离子化模式; 毛细管电压为 4.5 kV; 干燥气体、 雾化气体为氮气， 体积流量分别为 3.0 和 15 mL/min;碰撞气体 （CID） 氩气;DL管温度 250 ℃， 加热块温度 300 ℃; 产物离子扫描为 m/z135， 碰撞电压 35 V。 定量分析采用多反应监测 （MRM） 模式， 离子优化结果见表1。

表1 液质联用方法分析目标龙胆苯甲酸酯的优化参数Tab.1 LC-MS/MS parameters （ MRM ） for the selected analytes

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取苯甲酸酯对照品 gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K各适量， 精密称定对照品 2 mg， 分别放置于 2 mL量瓶中， 加95%乙醇溶解并定容至刻度， 摇匀，即各对照品贮备液 （1 mg/m L）。 分别精密吸取各贮备液适量，依 次 稀 释 得 质 量 浓 度 分 别 为 666.6、 444.4、296.3、 197.5、 131.7、87.8、59、 39、 26 μg/mL的对照品贮备液，备用。

2.2.2 供试品溶液 取滇龙胆干燥样品 （包括根、 茎、 叶、 种子）， 粉碎后过 100 目筛。 称取1.5 g样品， 加 入 95% 乙醇 10 mL， 超声提取40 min， 过滤， 滤液过 0.22 μm微孔滤膜， 即得。

2.3 线性关系考察 精密量取不同质量浓度的对照品溶液， 按上述 LC-MS 条件进样测定， 记录色谱图。 以对照品质量浓度 （x）为横坐标， 峰面积积分值 （y）为纵坐标，绘制标准曲线， 进行线性关系考察， 结果见表 2。 结果表明， gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K在相应质量浓度范围内呈现良好的线性关系 （r为 0.998 9 ～0.999 6）。

表2 4种成分的线性关系考察结果Tab.2 Linear regression data of gentisides

2.4 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液适量，按上述 LC-MS 条件连续进样 5 次， 测定峰面积。结果 gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K的 RSD分别为 1.1%、 1.2%、 1.0%、 1.8%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验 取同一份滇龙胆根部样品1.5 g， 共 6 份， 分别按 “2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 照上述 LC-MS/MS 条件进样测定。 结果gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K的RSD分别为 2.2%、 3.0%、3.5%、 2.5%， 表明本方法重复性良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液适量，同一日内每隔4 h 测定滇龙胆根样品 （重复6 次）;连续3 d 同一时间测定滇龙胆根样品 （重复6 次）。结果表明供试品溶液在室温放置 3 d 以内 gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K基本稳定，结果见表3。

表 3 日内与日间稳定性试验 （ n=6）Tab.3 Intra-and inter-day precision of methods（ n=6）

2.7 回收率试验 精密称取同一滇龙胆根部样品适量，共6份，分别精密加入一定量的对照品贮备液，按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液， 测定4种化合物的峰面积，计算回收率，测定结果见表4。 结果显示， 这 4种化合物的加样回收率为98.1% ～102.4%， RSD为0.7% ～1.7%。

表4 加样回收率试验结果 （n=6）Tab.4 Results of recovery tests（n=6）

2.8 样品测定 取不同部位的滇龙胆样品， 按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 照上述 LCMS/MS 条件进样测定，记录峰面积， 分别计算样品中 gentiside A，gentiside J， gentiside B， gentiside K的量， 结果见图 1， 图 2 和表 5。

图1 对照品二级离子扫描质谱图Fig.1 Product ion scan spectra of the reference substances

图2 对照品 （A） 和样品 （B） 的总离子流色谱图Fig.2 Total ions chrom atogram s of reference substances（A） and samples（B）

表5 滇龙胆不同部位苯甲酸酯的测定结果Tab.5 Contents of gentiside in different parts of G.rigescens

3 讨论

本研究采用 LC-MS/MS 方法， 对滇龙胆中 4 种苯甲酸酯类成分 gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K进行了同时测定， 操作简单、快速，为滇龙胆质量控制提供了新手段。

在一级全扫描 MS 图中发现， 4 个化合物 gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K在负离子模式下均易产生 ［M-H］-峰， 且响应值较高。在流动相中加入适量的甲酸有助于化合物的离子化， 故对甲酸的用量进行了考察， 发现当加入1%的甲酸时，各化合物峰形较好，且响应值稳定。最终确定以甲醇-水 （1%甲酸） 为流动相等度洗脱。

结果表明， 这 4 种苯甲 酸 酯 化 合 物 gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K在滇龙胆的根中含有量最高， 分别为 0.284、 0.358、 0.654、0.267 mg/g。茎中只含 gentiside J，叶中只含 gentiside K， 而种子中不含任何一种。本研究为建立滇龙胆药材的质量分析方法提供必要的参考依据，为滇龙胆药材的充分利用提供有力的技术支持。

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Sim ultaneous determ ination of four benzoate com pounds from Gentiana rigescens Franch.by LC-MS/MS

PAN Jun1， PAN Yu2， XIAO Dan1， LIZhi-min1， WANG Yuan-zhong1， LIWan-yi1*

（1.Instituteof Medicinal Plants， Yunnan Provincial Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650205， China;2.Yunnan University of TCM， Kunming 650500， China）

AIM A specific liquid chromatography-ion trap mass spectrometric（ LC-MS/MS） method was developed thatallowed simultaneous determination of four components（ gentiside A，gentiside J， gentiside B，gentiside K） of anti-dementia in Centiana rigescens Franch.METHODS By using the LC-MS/MSmethod， the four compounds were separated on a Shim-pack XR-ODS Ⅲ column （75 mm×2.0 mm， 1.6 μm） with amobile phase consisted ofmethanol and water containing 0.1%formic acid with isocratic elution.Electrospray ionization source（ESI） was applied and operated in negative ionizationmultiple reactionmonitoringmodel.RESULTS The linear ranges of gentiside A， gentiside J， gentiside B and gentiside K were 39.0 ～444.4 μg/mL（r=0.999 6） ， 39.0 ～444.4 μg/mL（r=0.999 0）， 59.0 ～444.4 μg/mL（r=0.998 9） and 26.0 ～444.4 μg/mL（r=0.999 4）， respectively.The contents of four benzoate compounds in the rootof Centiana rigescens Franch，were0.284， 0.358，0.654， 0.267mg/g， respectively.The recoveries ranged from 98.1%to102.6%， and RSDswere in the range of 0.7% ～1.7%.CONCLUSION Themethod is specific and precise， and can be used for the determination of benzoate compounds in Centiana rigescens Franch.

Centiana rigescens Franch;Alzheimer's disease;benzoate;LC-MS/MS

R284.1

:A

1001-1528（2014）12-2550-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.023

2013-11-22

云南省科技计划项目 （2012AE002）

潘 俊 （1982—）， 男， 助理研究员， 研究方向: 中药质量控制。 Tel:13987148730， E-mail:38435992@qq.com

*通信作者: 李晚谊 （1965 —） ， 女， 研究员。 研究方向: 中药质量控制。 Tel:13888784468， E-mail:wyli2012@126.com