LC-MS/MS法检查保健食品和中成药中非法添加磺胺药

姜建国, 张西如, 张轶华, 宋更申

（河北省药品检验研究院, 河北 石家庄 050011）

LC-MS/MS法检查保健食品和中成药中非法添加磺胺药

姜建国, 张西如, 张轶华, 宋更申

（河北省药品检验研究院, 河北 石家庄 050011）

目的 建立 LC-MS/MS 方法检查保健食品和中成药中非法添加的 22 种磺胺类药物。 方法 磺胺脒、 甲氧苄啶、磺胺二甲异嘧啶钠、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺甲二唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺多辛、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、磺胺苯酰、磺胺喹沙啉、 磺胺苯吡唑、 磺胺硝苯和磺胺间二甲氧嘧啶的乙腈溶液的 HPLC分析， 采用 C18色谱柱， 梯度洗脱; 流动相 A为 0.1%甲酸， 流动相 B为乙腈， 体积流量 0.3 mL/min。 质谱选择正离子模式和 MRM扫描方式。 结果 通过比较样品和对照品峰的一级和二级质谱图可测定上述磺胺类药物的最小检出量为 1 pg。 结论 本法对 38 批保健食品和中成药进行分析，4批样品出现一级和二级质谱与磺胺甲噁唑和甲氧苄啶对照品一致的图谱。

磺胺类药物; 非法添加;LC-MS/MS; 保健食品; 中成药

磺胺类药物为人工合成的抗菌药，用于临床已近50年， 它具有抗菌谱较广、 性质稳定、 使用简便、 生产时不耗用粮食等优点。 特别是 1969 年抗菌增效剂——甲氧苄氨嘧啶 （TMP） 发现以后，与磺胺类联合应用可使其抗菌作用增强、治疗范围扩大，因此，虽然有大量抗生素问世，但磺胺类药物仍是中药的化学治疗药物。由于磺胺类药主要经肝代谢灭活，形成乙酰化物的溶解度降低，因此，易引起血尿、结晶尿及肾损害，其不良反应还有恶心、呕吐、皮疹、发热、溶血性贫血、粒细胞减少、肝脏损害等，故肝肾功能差的尿路感染患者应慎用。近年来，在具有止咳平喘中药制剂和保健品中掺杂化学合成药物的情况时有发生，对消费者的身体健康造成严重危害。现有的国家标准只能分别检查单个或几个药物，对保健食品和中药制剂的定性检查效率不高， 目前 HPLC、 LC/MS 和 GC/MS技术已广泛用于同时测定多种成分［1-10］，且已有文献报道测 定 磺胺 类 药 物［11-14］。 本 实 验 建立 可 同 时检查 22 种磺胺类药物的 LC-MS/MS 检测方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 API3200 型三重四级杆串联质谱仪 （美国 Applied Biosystems公司）;Milli-Q去离子水止水系统 （ 美国 SPEXCertiPrep 公司）; 磺胺脒 （SGN， 批号 10916）、 甲氧苄啶 （TMP， 批号00802）、 磺胺二甲异嘧啶钠 （SIM，批号 20727）、磺胺醋酰 （SAA， 批号 00521）、 磺胺嘧啶 （SDZ，批号 00818）、 磺胺吡啶 （SPD， 批号 10121）、 磺胺 甲 嘧 啶 （ SMR，批 号 10903）、 磺 胺 二 甲 唑（SMO，批号 90928）、 磺胺二甲嘧啶 （SDM， 批号10310）、 磺胺甲氧嗪 （ SMP， 批号 00514）、 磺胺甲二唑 （SMT， 批号 20324）、 磺胺对甲氧嘧啶（SMD，批号 20411）、 磺胺间甲氧嘧啶 （SMM， 批号 01104）、 磺胺氯哒嗪 （SCP， 批号 20621）、 磺胺多辛 （SDX， 批号 01109）、 磺胺甲噁唑 （SMZ，批号 10405）、 磺胺异噁唑 （ SFZ， 批号 10319）、磺胺 苯 酰 （ SBA，批 号 00416）、磺 胺 喹 沙 啉（SQX， 批 号 80303）、 磺 胺苯吡唑 （ SPA， 批号00216）、 磺胺硝苯 （SAN， 批号 10310） 和磺胺间二甲氧嘧啶 （ SAX， 批号 20104） 对照品均购自Dr.Ehrenstorfer公司，纯度均大于 99.0%。 样品由本院提供。

1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取 22 种对照品适量， 加乙腈溶解并制成质量浓度为 0.1 mg/mL的贮备液。 用乙腈 -0.1%甲酸水 （20 ∶80） 配制成混合对照品溶液并稀释至所需要的系列质量浓度， 取系列溶液10 μL进样测定， 以定量提取离子对的积分值制成质量浓度-面积标准曲线。

1.3 样品溶液的制备 取所需测定样品10 片 （片剂、 胶囊和散剂）， 将内容物研细， 精密称取0.1 g至 50 mL的量瓶中， 加乙腈适量， 超声 （250 W，40 kHz） 提取 30 min， 放至室温并用乙腈稀释至刻度， 摇匀， 用 0.2 μm的滤膜过滤， 精密量取滤液适量， 用乙腈-0.1%甲酸水 （20 ∶80） 稀释至线性范围内质量浓度， 摇匀， 即得。 取 10 μL， 进样测定。

2 结果

2.1 色 谱 条 件 Altantis T3 色 谱柱 （2.1 mm× 100 mm， 3 μm）; 流动相 A为 0.1%甲酸， 流动相B为乙腈; 梯度洗脱 （0 ～5 min， 0.5% ～10%B; 5 ～25 min， 10% ～50%B;28 min 恢复到初始， 平衡 5 min）; 体积流量 0.3 mL/min; 柱温 30 ℃。

2.2 质谱条件 电喷雾离子源 （ESI）; 离子喷雾电压 （IS） 5.5 kV; 离子源温度 （TEM） 550 ℃;气帘 气 （ CUR） 10 L/min; 雾 化 气 （ GAS1） 40 L/min; 辅助气 （GAS2） 30 L/min; 采集方式为多反应监测 （MRM）。 正离子化模式选择和提取离子选择均以灵敏度高、稳定性好为前提条件。各化合物的定性和定量离子见表 1， 色谱图见图1。

表1 质谱相关参数Tab.1 Mass spectrometry parameters

3 方法学考察

3.1 线性关系考察 取 “1.2” 项所示贮备液逐一稀释成系列质量浓度溶液 10 μL进样，计算各成分的线性方程，相关系数和 RSD值 （n=6）， 详见表2。

3.2 精密度试验 取 “表 2” 22 种药物的中间浓度， 分别进样 10 μL， 连续进样 6 次， 记录色谱图， 分别计算 RSD （n=6）， 最大值为 1.8%。

图 1 22 种磺胺类药物的选择离子色谱图Fig.1 Chromatograms of 22 kinds of sulfonam ides in SIM mode

3.3 溶液的稳定性 分别取 “表 2”22 种药物的中间浓度置于室温下放置， 于 0、 2、 4、 6、 8 h，取 10 μL进样， 记录色谱图， 峰面积 RSD （n=6）最大值为1.5%， 表明22 种溶液在 8 h 内均稳定。

3.4 检出限 将 22 种对照品贮备液逐级稀释， 以S/N=3 计算检出量， 以上药物的检出量最低为1 pg。

表 2 22 种药物的线性方程， 线性范围， 线性相关系数Tab.2 Linear equation， linear range， correlation coefficient and recovery of 22 drugs

4 实际样品的测定

利用建立的方法对我所近 5年检查的38批保健食品和中成药进行分析，4批样品出现一级和二级质谱与磺胺甲噁唑和甲氧苄啶对照品一致的图谱，进一步经二极管阵列检测器检测，其紫外光谱亦与磺胺甲噁唑和甲氧苄啶对照品一致，判定这4批样品中非法添加了磺胺甲噁唑和甲氧苄啶，其余样品均未检出。见表3。

表 3 22 种药物在样品中的测定结果 （n=3）Tab.3 Results of 22 drugs in samples（ n=3）

5 讨论

5.1 标准溶液和样品溶液的配制 磺胺类药物的基本结构为对氨基苯磺酰胺，大多数此类药物在水中的溶解度较低，且对光不稳定，所以应使用乙腈作为溶剂配制磺胺类对照溶液，并避光保存。在液相色谱分析中，样品稀释一般都使用有机溶剂和水的混合液体。 实验中发现当使用乙腈-水或甲醇-水的混合溶液时，稀释溶液中有机溶剂的比例高于色谱洗脱程序起始时有机相比例的2倍时，就会出现色谱峰分裂现象，各成分的峰形对称，无拖尾现象。

5.2 样品的提取 由于保健食品和中成药多为片剂、胶囊、软胶囊和颗粒剂等，且大多为复方制剂，中成药中每味中药材的成分又十分复杂，对分析方法的选择性要求更高， 因此本实验采用 LCMS/MS 对其中添加的磺胺类药物进行定性分析，并定量测定。

样品的提取方法不尽相同，对片剂、胶囊剂等固体制剂可以直接研细，称取细粉加乙腈溶解、过滤即可，对含糖较多的颗粒剂用乙腈溶解时，可以消除蔗糖的干扰，有效的保护色谱柱，提取方法操作简单。

5.3 样品的测定结果 从表 3 中可以看出， 4 批样品被检测出磺胺甲噁唑和甲氧苄啶，其中3批样品为中成药散剂，且其中一批检出量较高，检出率为 10.5%。因此应加强对中成药非法添加的控制。

5.4 色谱和质谱条件的优化 实验中，使用几种不同的反相色谱柱进行分离，结果发现在现有的色谱洗脱条件下， Altantis T3 （2.1 mm×100 mm， 3 μm）由于填料颗粒细，使峰形更加对称尖锐， 信噪比更高，因此最终选择该色谱柱作为分离柱。可以将同分异构体及母离子和碎片离子一致的药物区分开，使定性更准确，在流动相中加入适量甲酸，可以提高灵敏度， 经试验当甲酸的使用量在 0.1%为宜。

5.5 建立了 HPLC-MS/MS 同时测定 22 种磺胺类药物的方法，记录了所测化学药的紫外光谱、一级质谱和二级质谱图，使用质谱仪自身所配软件储存上述信息，并录入相应名称、结构等信息，当分析未知物时，可先根据采集的信息在库中搜索匹配的药物，再用相应的对照品进样分析，既减少了交叉污染的可能性，又可以节省大量的摸索试验时间，实现短时间内对未知成分进行确认的目的，方法操作简便、快速可靠、灵敏度高，可以用于监测保健食品和中成药中的违法添加化学药的情况，为市场监管提供技术支持。

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Detecting illegally added sulfonam ides in health foods and herb preparations by LC-MS/MS

JIANG Jian-guo， ZHANG Xi-ru， ZHANG Yi-hua， SONG Geng-shen

（ Hebei Provincial Institute for Drug Control， Shijiazhuang 050011， China）

AIM To establish LC-MS/MSmethod to detect illegally added twenty-two kinds of sulfonamides in health foods and herb preparations.METHODS The analysis of the acetonitrile solutions of SGN， TMP， SIM，SAA， SDZ， SPD， SMR， SMO， SDM， SMP， SMT，SMD，SMM， SCP， SDX， SMZ， SFZ， SBA，SQX，SPA，SAN， and SAX were performed on C18chromatographic column in a gradient elution mode.Mobile phase consisted of 0.1%formic acid （ A phase） and acetonitrile（ B phase） ， the flow rate was 0.3 mL/min.Cationic mode and MRM scanning were selected in NM analysis.RESULT Comparison wasmade between the primary and secondarymass spectra of samples and reference compounds.The lower detection limit of sulfonamides was 1 pg.CONCLUSION Thismethod successfully detects the presence of SMZ and TMP in the primary and secondary mass spectra in four samples from thirty-eight kinds of health foods and herb preparations.

sulfonamides;illegally added;LC-MS/MS;health foods;herb preparations

R927.2

:A

1001-1528（2014）12-2542-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.021

2013-11-27

姜建国 （1965—）， 硕士， 主任药师， Tel: （0311） 85212004-8040， E-mail:49567976@qq.com