星点设计-效应面法优化加味圣愈汤的提取工艺

杨秀梅, 欧小群, 谭茂兰, 汤朝晖, 李炜弘, 黄勤挽（成都中医药大学, 四川 成都611137）

星点设计-效应面法优化加味圣愈汤的提取工艺

杨秀梅, 欧小群, 谭茂兰, 汤朝晖, 李炜弘, 黄勤挽*（成都中医药大学, 四川 成都611137）

目的 利用星点设计-效应面法优化加味圣愈汤 （人参、 黄芪、 白芷、 三棱等组成） 的提取工艺。 方法 以乙醇体积分数、 溶剂倍数、 提取时间为自变量， 以人参皂苷 Rg1、 Re、 Rb1、 欧前胡素、 异欧前胡素的总评归一值为评价指标， 拟合二次项方程， 绘制三维效应面图， 选取最佳提取工艺。 结果 最佳提取工艺为:72%乙醇， 溶剂倍数为10 倍， 提取 2 次， 每次 2.5 h。 结论 星点设计-效应面法优化加味圣愈汤的提取工艺方法简便， 预测性好。

加味圣愈汤;提取工艺;星点设计;效应面

加味圣愈汤主要由人参、黄芪、白芷、三棱等药味组成，来源于成都中医药大学附属医院临床经验方，用于治疗黄褐斑，用药历史悠久，临床疗效好。

该方原来临床应用为煎煮成浓汤后浸泡纱布敷脸使用，但患者使用不方便，现拟进行剂型改革制备成水凝胶剂，本实验研究其提取工艺，为后续成型工艺和质量标准奠定基础。 星点设计-效应面法由于其精密度较高、预测性较好，近年来在工艺筛选方面应用广泛［1-5］，本 研究即 优化加 味圣愈汤的醇提工艺。处方中主要分为补气和活血化瘀类中药，因此本实验选取补气类中药人参有效成分人参皂苷［6］， 以及活血化瘀类中药白芷的有效成分欧前胡素、异欧前胡素为评价指标，结合干膏收率，进行工艺优化。

1 仪器与试药

Agilent 1200 高 效 液 相 色 谱 仪， Agilent ChemStation 工 作 站，BP211D电 子 天 平 （德 国Sartorius公司） ， Sepax bio-C18色 谱 柱 （ 4.6mm ×250mm， 5μm） （ 美 国 Sepax Technologies公司）。 人 参 饮 片 （ 批 号 1206020）、 黄 芪 饮 片（批号 1301003）、 白芷饮片 （批号 1304003）、三棱饮片 （批号 1306016） 等， 均购于四川新荷花中药饮片有限公司，经过成都中医药大学卢先明教授鉴定， 符合 《中国药典》 2010 年版规定。人参皂苷 Rg1对照品 （批号 120925）、 人参皂苷 Re对照品 （批号 121107）、 人参皂苷Rb1对照 品 （ 批 号 130129 ）、 欧 前 胡 素 对 照 品（批号 120903）、 异 欧 前 胡 素 对 照 品 （ 批 号121209）， 均由成都普菲德生物技术有限公司提供，五种对照品均供定量测定用，纯度≥98%。分析甲醇，色谱乙腈，超纯水等。

2 方法与结果

2.1 定量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取欧前胡素、异欧前胡素对照品适量， 置10 mL量瓶中， 加甲醇溶解，即得欧前胡素、异欧前胡素混合对照品溶液; 精密称取人参皂苷 Rg1、Re、 Rb1对照品适量，置 10 mL量 瓶 中， 加 甲 醇 溶 解， 即 得 人 参 皂 苷Rg1、 Re、 Rb1混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密吸取各提取液5 mL， 水浴 挥 干， 用 甲 醇 溶 解 残 渣 ，置 10 mL量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.1.3 阴性样品溶液的制备 按处方量称取除人参外的各药材饮片， 加8 倍量70%乙醇， 提取2 h，提取液按 “2.1.2”项下进行处理， 即得人参阴性样品溶液;按处方量称取除白芷外的各药材饮片，加 8 倍量 70%乙醇， 提取2 h， 提取液按 “2.1.2”项下进行处理，即得白芷阴性样品溶液。

2.1.4 色谱条件

2.1.4.1 人参皂苷 测 定 色 谱 条件 Sepax bio-C18色 谱 柱 （ 4.6 mm×250 mm， 5 μm） ， 流 动 相 为乙 腈 （ A） -水 （ B） ， 梯 度 洗 脱 ， 0 ～10 min，20%A;10 ～25 min， 20% ～27%A;25 ～45 min，27% ～40%A。 体 积 流 量 1.0 m l/min， 柱 温25 ℃， 检查波长 203 nm， 进样体积 10 μL。 该色谱条件下，各检测组分分离度良好，且无阴性干扰，见图1。

2.1.4.2 欧前胡素、 异欧前胡素测定色谱条件［7］Sepax bio-C18色 谱 柱 （ 4.6 mm ×250 mm， 5 μm）， 甲醇-水 （70 ∶30） 为流动相， 体积流量1.0 mL/min， 柱 温 30 ℃ ，检测波长 251 nm，进 样体积 10 μL。 该色谱条件下， 各检测组分分离度良好， 且无阴性干扰， 见图1。

图 1 人参皂苷、 欧前胡素、 异欧前胡素的 HPLC图Fig.1 HPLC fingerprint of ginsenosides， im peratorin and isoim peratorin

2.1.5 方法学考察

2.1.5.1 标准曲线的制备 精密吸取 “2.1.1”项下的混合对照品溶液 2、4、 6、 8、 10、 12 μL，进样分析， 以进样量 （μg） 对峰面积积分值进行线性回归，结果表明各成分在相应的范围内，线性关系良好， 见表1。

表 1 欧前胡素、 异欧前胡素、 人参皂苷 Rg1、 Re、 Rb1、的线性范围Tab.1 Linearities and ranges of ginsenosides， imperatorin and isoimperatorin

2.1.5.2 精密度试验 精密吸取 “2.1.1”项下的混合对照品溶液 10 μL， 连续进样 6 次， 记录人参皂苷 Rg1、 Re、 Rb1、 欧前胡素、 异欧前胡素的峰面积， 其峰面积的 RSD分别为 0.56%、 0.67%。1.01%、 0.62%、 0.58%， 表明精密度良好。

2.1.5.3 重复性试验 按处方比例称取处方中各饮片 （平行称取 6 份）， 分别加入 8 倍量 70%乙醇， 提取 2 h， 测得各样品中人参皂苷 Rg1、 Re、Rb1、 欧前胡素、 异欧前胡素的平均质量分数分别为 0.05%、 0.03%、 0.14%、0.59%、 0.84%，RSD分 别 为 1.21%、 1.36%、 1.28%、1.13%、1.16%， 表明重复性良好。

2.1.5.4 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液10 μL， 分别于 0、 2、 4、 6、 8、 12、 24、 36 h 进样， 测定人参皂苷 Rg1、 Re、 Rb1、 欧前胡素、 异欧前胡素峰面积，其峰面积的 RSD分别为1.31%、1.26%、 2.02%、 1.12%、 1.16%， 表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.1.5.5 加样回收试验 按处方比例称取处方中各饮片 （平行称取 6 份）， 精密加人参皂苷 Rg1、Re、 Rb1、 欧前胡素、 异欧前胡素对照品分别为7.45、14.89、 16.86、 2.67、 1.31 mg，加入 8 倍量 70%乙醇， 提取 2 h， 测定， 计算人参皂苷 Rg1、Re、 Rb1、 欧前胡素、 异欧前胡素的加样回收率的平均 值 分 别 为 100.32%、 101.03%、 100.21%、99.16%、 99.98%， RSD分别为 1.66%、2.03%、1.32%、 1.14%、 1.23%。

2.2 干膏收率的测定 取各提取液 25 mL于已干燥至恒重的蒸发皿中， 水浴蒸干， 置105 ℃烘箱中干燥3 h， 取出， 冷却至室温， 称定质量并计算干膏收率。

2.3 单因素实验选取因素及相关水平

2.3.1 乙醇体积分数对提取效果的影响 按处方比例称取各中药饮片， 分别以纯水、 30%、 40%、50%、 60%、 70%、 80%、 90%乙醇为提取溶剂，加入 8 倍溶剂量， 提取两次， 每次 1.5 h， 合并滤液， 测定各指标。 结果表明， 以 70%乙醇为溶剂时，人参皂苷及欧前胡素的提取效率最高;以80%乙醇为溶剂时， 异欧前胡素提取效率最高。 最后选取乙醇体积分数上限为 80%， 下限为 60%。

2.3.2 溶剂倍数对提取效率的影响 按处方比例称取各中药饮片， 分别加入 6、 8、 10、 12、 15、20 倍 70%乙醇溶液， 提取 2 次， 每次 1.5 h， 合并滤液，测定各指标。结果表明，各指标的提取效率随提取溶剂量的升高而升高， 但溶剂量增大到12倍时，提取效率增大不明显，因此选择溶剂倍数的上限为12倍溶剂量， 下限为6倍溶剂量。

2.3.3 提取时间对提取效率的影响 按处方比例称取各中药饮片， 加 8 倍量 70%乙醇， 分别提取0.5、1、 1.5、 2、 3 h，合并滤液， 测定各指标。各指标的提取效率随提取的时间增加而增加，但是当提取时间增加到2 h时，提取效率增加不明显，因此选取提取时间的上限为 2.5 h， 下限为1.5 h。

2.3.4 提取次数对提取效率的影响 按处方比例称取各中药饮片， 加 8 倍量 70%乙醇， 分别提取1、 2、 3 次， 每次1.5 h， 合并滤液， 测定各指标。结果表明各指标均随提取次数的增加而增加，但提取3次比提取2次增加不明显，因此提取次数确定为2次。

2.4 星点实验设计与结果 据单因素实验结果，提取次数确定为 2 次， 选取乙醇体积分数 （A）、提取时间 （B）、 溶剂倍数 （C） 作为考察对象，采用 Design Expert7.0 统计分析软件， 以人参皂苷Rg1、 Re、 Rb1、 欧前胡素、 异欧前胡素、干膏收率的总评 OD值为响应值， 进行星点设计-效应面法优化实验，选取最佳提取工艺参数。因素水平见表 2， 实验安排及结果见表3。

表2 星点设计因素与水平Tab.2 Factors and levels

表3 星点实验安排及结果Tab.3 Central com posite design and results

2.5 模型的建立 以总评 OD值对各因素进行多元线性回归和二次项拟合，得多元线性方程:

Y=-1.191 57+9.402 35 ×10-3A+0.439 32B +0.017 443C， （r=0.680 7， P=0.016 6）;

二次项方程:

Y=-14.354 44+0.299 10A+3.137 10B+ 0.154 14C-4.797 67 ×10-3AB+1.507 99 ×10-4AC+ 8.776 48 ×10-4BC-2.010 39 ×10-3A2-0.592 46B2-8.278 05 ×10-3C2， （r=0.9733， P＜0.01）

从r值可知，二次项拟合方程复相关系数（r=0.973 3） 较高，该方程拟合度高， 可信度较大，预测性较好。选取二次项拟合方程为模型，固定3个自变量之一为中值， 以总评 OD为因变量，绘制效应面三维图， 见图2。

图2 三维效应图Fig.2 3D response sur face

基于建立的数学模型，对工艺进行最优化设计， 得到最佳的工艺参数为:71.95%乙醇， 溶剂倍数为 10.09 倍， 提取时间为 2.36 h。 结合实际生产， 本实验选取的最佳提取工艺为 72%乙醇， 溶剂倍数为 10 倍， 提取时间2.5 h。

2.6 验证实验 据最佳工艺条件， 称取 5 倍原药材量3 份， 分别加入10 倍量72%乙醇， 提取2 次，每次 2.5 h。 测定各指标， 结果与拟合方程预测的最大值相比较，见表4。

表 4 验证实验结果 （n=3）Tab.4 Validation test（ n=3）

预测值与实测值偏差较小，表明建立的数学模型预测性较好。因此，确定最佳的提取工艺为: 72%乙醇， 溶剂倍数为 10 倍， 提取 2 次， 每次2.5 h。

3 讨论

中医学认为黄褐斑病因病机与肝、脾、肾功能失调以有关［8-10］， 长期的精神压力， 所思不遂致使气机郁结， 肝郁气滞， 血瘀于面［11］; 饮食或思虑伤脾，致使脾气虚弱难以运化水谷精微，久则造成气血不足不养于面;稟赋素亏，或由于房事不节，或孕产过 多， 致使肾中精 血 亏 虚， 肌肤失养［12］。气血亏虚，气滞血瘀，精血不能上荣于面是黄褐斑发生的基本病机［13］， 治疗当以益气养血、 活血化瘀为基本原则。该方以人参大补元气，补益脾肾之气，为君药;黄芪健脾补中、升阳举陷、托毒生肌，三棱破血行气，白芷燥湿排脓，升阳明清气，三药共用为臣药。君臣相配，意在益气补血，活血理气化瘀，托毒排脓生肌，以荣养面表肌肤。纵观全方，以培补肺脾肾，益气补血治其本，以活血化瘀、排毒生肌以治其标，标本兼治，以达到消除色斑，美白养颜的效果。

近年来， 星点设计-效应面法在中药提取工艺的优化方面应用广泛，适宜于非线性模型拟合，精密度高， 预测性好［14］。 本实验在单因素试验的基础上， 利用星点设计-效应面法进行提取工艺筛选，为处方中的有效成分的提取提供依据。本实验以多个评价指标进行提取工艺筛选，能较为全面地反应有效成分的提取效率，但每个指标优选出的条件可能并不完全一致。为了能反应总体效应结果，本实验采用 “归一化”法， 对各指标结果进行 “归一化” 处理， 计算出总评 OD值， 以总评 OD值为综合评价指标，以得到综合效应较佳的提取工艺，且使实验模型具有更好的预测性。基于建立的数据模型，优化出最佳的工艺参数为:71.95%乙醇， 溶剂倍数为 10.09 倍， 提取时间为 2.36 h。 该工艺的总评 OD值的预测值为 0.8901， 3 次验证实验的总评 OD值的平均值为 0.899 6， 偏差为 1.07%，结果表明采用星点设计-效应面法， 优化加味圣愈汤的提取工艺，方法简便，且预测性较好。但该结果为实验室小试数据，有待放大实验的进一步验证。

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Extraction optim ization of Supp lemented Shengyu Decoction by central composite design-response surfacem ethod

YANG Xiu-mei， OU Xiao-qun， TAN Mao-lan， TANG Zhao-hui， LIWei-hong， HUANG Qin-wan*

（ Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

Supplemented Shengyu Decoction;extraction;central composite design;response surface

R284.2

:A

1001-1528（2014）12-2512-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.015

2013-12-04

四川省科技厅支撑计划 （2012FZ0017）; 成都市科技局课题 （12DXYB310JH）

杨秀梅 （1988—）， 女， 硕士生， 主要从事中药新制剂新技术的研究。 Tel:13568997942， E-mail:564004232@qq.com

*通信作者: 黄 勤 挽 （ 1979—） ， 男， 博 士， 副 教 授， 硕 士 生 导 师， 从 事 中 药 炮 制 与 中 药 制 剂 研 究。 Tel:13982199974， E-mail: 36190587@qq.com

日期:2014-06-23

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20140623.1601.001.html