小儿牛黄清心散预防大鼠惊厥作用的研究

李文娟， 蒋 莉， 陈恒胜， 陈小璐

（重庆医科大学附属儿童医院 儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室， 儿科学重庆市重点实验室，重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地， 重庆 400014）

小儿牛黄清心散预防大鼠惊厥作用的研究

李文娟， 蒋 莉*， 陈恒胜， 陈小璐

（重庆医科大学附属儿童医院 儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室， 儿科学重庆市重点实验室，重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地， 重庆 400014）

目的 观察小儿牛黄清心散对幼年大鼠惊厥的预防效果。 方法 将 130 只 21 d 的 SD大鼠随机分为在体研究组和脑片组。 在体研究组分为 7 个亚组: 正常对照组、 空白对照组、 生理盐水对照组， 安定对照组 (2.632 mg/kg·d)，小儿牛黄清心散低 (0.3 g/kg·d)、 中 (8 g/kg·d)、 高剂量组 (16 g/kg·d)， 每个亚组 10 只， 安定、 小儿牛黄清心散灌胃， 早晚 2 次灌胃， 给药 1 d。 在第 2 次给药结束后 30 min， 除空白对照组给予等体积的生理盐水腹腔注射外，余各组腹腔注射戊四唑 (70 mg/kg)， 观察各组惊厥发作的潜伏期， 发作程度， 持续时间， 死亡率， 同步脑电图变化。组织水平研究的动物分为6个亚组:正常对照组，生理盐水对照组，安定对照组，小儿牛黄清心散低、中、高剂量组。 给药方法同在体研究组。 在第 2 次给药结束后 30 min， 制作急性脑片， 记录在无镁人工脑脊液中各组脑片皮层和海马场电位出现的潜伏期，放电波出现的频率，幅度。结果 小儿牛黄清心散中、高剂量干预组可明显延长戊四唑诱导大鼠惊厥的潜伏期， 缩短惊厥发作时间， 降低死亡率 (P＜0.01)， 改善脑电图情况， 小儿牛黄清心散中、 高剂量干预组可明显降低无镁诱导脑片皮层和海马 CA1 区的发作率， 延长潜伏期， 降低场电位的频率及波幅。 结论 小儿牛黄清心散有较好的预防幼年大鼠惊厥的作用，并呈剂量依赖性。

小儿牛黄清心散；惊厥；戊四唑；无镁；幼年大鼠

惊厥是小儿时期最常见的神经系统急症，在儿童中的发生率高达 3% ～5%， 且与成人相比， 小儿惊厥更易出现严重惊厥和惊厥持续状态，导致惊厥性脑损伤［1］。

目前临床上主要采用苯二氮艹卓类与抗癫痫药物 (anti-epilepsy drugs， AEDs) 控制及预防惊厥发作，但反复服用此类药物可能影响儿童的认知发育［2］，内分泌功能［3］及骨骼的发育［4］。 中药是我们的祖先在长期的医疗实践中积累起来的财富，受到国人的青睐，但由于缺少对药物疗效的科学评价，在临床上使用受限。

因此，本实验拟通过戊四唑制备幼年大鼠在体急性惊厥模型，并以无镁诱导制备脑片水平的惊厥模型，在整体和组织水平，探究小儿牛黄清心散预防幼年大鼠惊厥发作的作用，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用 21 日龄 SD大鼠 130 只， 雌雄各半， 体质量 (45 ±5)g， 由重庆医科大学动物实 验 中 心 提 供， 动 物 许 可 证 号:syxk (渝)20040001。

1.1.2 主要试剂及器材 小儿牛黄清心散 (山东方健制药有限公司提供， 国药准字 Z37020495)；戊四唑 (pentylenetetrazole，PTZ) ，用 生 理 盐 水 配成 1%的戊四唑溶液； 正常人工脑脊液 (artificial cerebrospinal fluid， ACSF， mmol/L) 配方［5］:NaCl 124，KCl2.8 ，NaHCO326，NaH2PO41.25， 维生素C 0.4， 丙酮酸钠 2， 乳酸钠 2，D-葡萄糖 10， CaCl22， MgSO41.2； 切片液配方 (mmol/L)［5］:KCl 3 ，NaHCO326， NaH2PO41.25， 维生素 C 0.4， 丙酮酸钠 2， 乳酸钠 2，D-葡萄糖 10， CaCl20.1， MgSO44，MgCl22， 蔗糖 220，( 上 述试剂均购自 sigma公司)； 振 荡 切 片 机 ( 购 自 World Precision Instruments) ， 放 大 器 (Axon Instruments multiClamp 700B)， 显 微 镜 (Nikon 公 司)， 微 电 极 拉 制 器(美国 Sutter Instrument公司)， 脑电图记录仪 ( 美国 IWORX公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与给药 130 只 SD大鼠按照随机数字表法随机分为在体研究组和脑片组2个大组，在体研究组分为7个亚组:正常对照组、空白对照组、生理盐水对照组，安定对照组，小儿牛黄清心散低、 中、 高剂量组， 每个亚组 10 只。 除正常对照组外， 余各组分别给予生理盐水 2 mL/次、安定2.632mg/(kg·d)(相当于儿童 0.5 mg/kg的临床用量)， 小 儿 牛 黄 清 心 散 0.3 g/(kg· d)， 8 g/(kg·d)， 16 g/(kg·d)灌胃［6］( 安定及小儿牛黄清心散均分别溶于等体积的生理盐水中)。各组均于早晚2次灌胃，给药1 d。 脑片组分为6个亚组:正常对照组、生理盐水对照组，安定对照组，小儿牛黄清心散低、中、高剂量组。给药方法同在体研究组。

1.2.2 模型的制作 在体研究中， 参照文献方法，稍作改进， 在动物日龄 16 d时于皮层顶叶硬膜外放置电极［7-8］， 并继续母乳喂养至 21 d 给药［9］。 实验动物在第二次灌胃结束后 30min， 正常对照组不予处理，空白对照组给予等体积的生理盐水腹腔注射， 其余各组动物均给予腹腔注射戊四唑 (70 mg/kg)， 观 察 各 组 动 物 在 戊 四 唑 腹 腔 注 射 后30 min内的行为学表现及死亡情况， 按照 racine［10］标准，记录各组幼鼠惊厥发作的潜伏期，发作级别，发作持续时间。从腹腔注射生理盐水或戊四唑后开始对各组动物进行同步脑电图描记［7-9］。

脑片研究组， 在第 2 次灌胃结束后 30 min， 制作急性脑片［11］(切片液和记录液配方如前所述)，记录各组脑片的皮质区和海马 CA1 区从无镁诱导至场电位放电波出现的时间及放电波的波幅，频率，放电持续时间，正常对照组脑片用于记录正常人工脑脊液环境下的场电位的基线情况。

1.3 统计学处理 采用 SPSS 17.0 软件对实验数据进行统计分析，所有计量资料符合正态分布者用表示， 组间比较采用单因素方差分析， 方差齐者用 LSD法， 不齐者， 采用 Tamhane's T2(M)法， 不符合正态分布者用四分位间距 M(Q) 表示， 等级资料采用非参数的秩和检验， 以 α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 在体观察小儿牛黄清心散预防戊四唑诱导惊厥的效果 以戊四唑注射后各组幼鼠惊厥发作的潜伏期，发作持续时间，发作程度，死亡数为指标，比较药物的疗效， 结果如表1。 结果显示， 与生理盐水对照组相比，中、高剂量的小儿牛黄清心散组的动物的惊厥发作级别明显降低，持续时间显著减少， 死亡率明显降低 (P＜0.05)。 高剂量组与中剂量相比，高剂量组实验动物惊厥发生的潜伏期显著延长，发作级别明显降低，持续时间明显减少(P＜0.05)， 高剂量组与安定组相比， 无显著差异(P＞0.05)。

2.2 各组动物脑电图的比较 各组发作持续期的典型的脑电图检测情况如图1， 正常组幼年大鼠的脑电图为低幅的 α或 β波， 散在 θ 波。 注射 PTZ后，生理盐水组动物脑电图异常，可见尖波、棘波、 棘-慢、 尖-慢波等癫痫波发放， 波幅较高， 安定组及清心散高剂量组动物脑电图未见明显异常。而使用中、低剂量组脑电图可见散在中、高波幅的尖、棘波、尖 (棘) 慢综合波。

表1 戊四唑诱导后各组大鼠急性惊厥潜伏期、 惊厥持续时间、 惊厥发作程度的比较 M （Q）Tab.1 Com parison of the latent period and seizure time and seizure scores of each group after the injection of PTZ M （ Q）

2.3 脑片水平研究小儿牛黄清心散预防无镁人工脑脊液诱导惊厥的效果 在组织水平研究组中，以脑片为对象，比较各组无镁人工脑脊液诱导后惊厥发生的潜伏期，发作率，波幅，频率，结果如表2， 图 2、3 所示。 正常对照组的脑片在正常的人工脑脊液环境中，皮层和海马组织均不能诱导惊厥发生， 场电位基线平稳， 波幅为 0mv。 在无镁诱导的惊厥模型中，随着无镁诱导的潜伏期的延长，小儿牛黄清心散低、中剂量组、生理盐水对照组均可诱导痫性放电发生，表现为场电位的频率及波幅增高。而生理盐水组、中剂量干预组、高剂量干预组， 三者比较差异有显著意义 (P＜0.05)， 提示中剂量和高剂量干预组均可以缩短无镁诱导惊厥发生的潜伏期，降低脑片场电位的频率及波幅，高剂量效果较中剂量明显，高剂量干预组可显著降低发作率，而中剂量对发作率的改善并不明显。中剂量干预组与低剂量干预组相比，脑片放电发作的潜伏期、频率、波幅均显著低于低剂量干预组 (P＜0.05)。 而低剂量干预组与生理盐水组在上述指标的比较未见显著差异 (P＞0.05)。

图1 各组脑电图检测情况Fig.1 EEG of each group

3 讨论

小儿牛黄清心散是我国民间广泛应用的一种中药复方制剂，主要含有天麻、胆南星、黄连、赤芍、 大黄、 全蝎、 水牛角浓缩粉、 僵蚕 (麸炒)、牛黄、 琥珀、雄黄、 冰片、朱砂、 金礞石 (煅)等14味中药。传统医学认为其主要用于小儿内热、急惊痰喘、四肢抽搐、神志昏迷的治疗。

关于小儿牛黄清心散的配方中单一药物成分的抗惊厥的药效及机制的研究比较多见，如天麻有抗惊厥的作用［12］，天然冰片可能通过调节脑内氨基酸类神经递质的水平来改善模型小鼠的惊厥行为［13］。 根据中药配伍应用的特色， 对中药复方的研究更能体现中医学的整体疗效［14］， 针对目前国内尚缺乏对小儿牛黄清心散复方制剂预防惊厥作用的药效评价的研究。本研究通过制作急性惊厥模型，在整体和组织层面观察小儿牛黄清心散的止惊疗效。

表3 各组无镁诱导脑片海马 C A1 区及皮层场电位的情况 （）Tab.3 Field potential of CA1 region of the hippocam pus and the cortex of brain slice in each group induced by the M g2+ free artificial cerebrosp inal fluid（）

表3 各组无镁诱导脑片海马 C A1 区及皮层场电位的情况 （）Tab.3 Field potential of CA1 region of the hippocam pus and the cortex of brain slice in each group induced by the M g2+ free artificial cerebrosp inal fluid（）

注:与生理盐水组、清心散低剂量组比较，*P＜0.05

组别海马 CA1区场电位皮层场电位脑片数 潜伏期 /min发作率 /%频率 /Hz波幅 /mV脑片数潜伏期 /min发作率 /%频率 /Hz波幅/mV生理盐水组1050.24 ±6.441008.59 ±1.260.640 ±0.0751029.57 ±2.871007.89 ±0.160.228 ±0.055正常对照组10---------安定对照组10-0- - 10-0- -清心散低剂量组1049.58 ±5.211008.67 ±1.160.648 ±0.0991029.75 ±3.041007.95 ±0.220.209 ±0.037清心散中剂量组1095.47 ±2.74*100*3.89 ±0.73*0.298 ±0.067*1082.88 ±13.28*100*3.92 ±0.21*0.176 ±0.012*清心散高剂量组10-0- - 10-0--

戊四唑诱导的急性惊厥模型是复制急性全身性惊厥发作的一种常用模型［15］。 被广泛应用于癫痫发病机制的研究、抗癫痫药物的筛选以及治疗方法的探索等［6］。 因此， 我们采用戊四唑所致惊厥模型，在动物整体水平，从行为学角度研究小儿牛黄清心散的止惊疗效，结果提示小儿牛黄清心散可呈剂量依赖性地对抗戊四唑诱导的急性惊厥，降低发作率，延长惊厥发作的潜伏期，降低发作级别，缩短惊厥发作的持续时间，降低死亡率，其中，高剂量干预组可有效改善脑电图的痫性放电，与惊厥发生的行为学变化一致。高剂量干预组与安定组预防惊厥的效果比较没有显著差异。

在整体研究的基础上，我们进一步采用脑片观察小儿牛黄清心散的止惊疗效。无镁诱导脑片的惊厥模型是常见的经典脑片惊厥模型之一［11］。 有研究表明无镁诱导的脑片异常放电的起源自内嗅皮层， 继而向颞叶皮层及海马结构传播扩散［16］， 因此，皮层和海马作为癫痫发作的易感区域，参与了癫痫电活动的起源、传播及扩散，而皮层和海马细胞外场电位是皮层和海马结构神经环路兴奋性的总体体现。本实验中发现小儿牛黄清心散可呈剂量依赖性预防无镁诱导脑片的痫性放电，且高剂量的小儿牛黄清心散对无镁诱导的脑片有较好的抗惊厥作用，效果与安定组相当。

图2 各组无镁诱导脑片海马 CA1区场电位情况Fig.2 Field poten tial of CA1 region of the hippocampus of brain slice induced by the M g2+free artificial cerebrospinal fluid in each group

图3 各组无镁诱导脑片皮层场电位的情况Fig.3 Field poten tial of the cortex of brain slice inducedby the M g2+free artificial cerebrospinal fluid in each group

本研究虽在动物水平和脑片水平均证实了小儿牛黄清心散高剂量组有较好的预防惊厥的作用，在动物水平的研究结果可以为临床的进一步大样本前瞻性的研究提供一定的指导，但由于中药起效较慢，故不适用于惊厥急性发作的处理，只可能作为预防惊厥发作的选择药物之一。其具体预防惊厥的机制也有待进一步深入研究。

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Anticonvulsive effect of Child Niuhuang Qingxin Powder on seizures in infantile rats

LIWen-juan， JIANG Li*， CHEN Heng-sheng， CHEN Xiao-lu

(Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders， Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing， Chongqing International Science and Technology Cooperation Center for Child Development and Disorders， Children's Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing 400014， China)

ABSTRACT:AIM To study the preventive effectof Child Niuhuang Qingxin Powder(CNHQX)on convulsant action in the infantile rats.METHODS One hundred and thirty infantile Sprague-Dawley(SD)rats were equally randomized into twomain groups including in vivo group and brain slice group and the former group were subdivided into 7 subgroups(normal control group，blank control group， saline control group， diazepam group(2.632 mg/kg·d)， low-dose， middle-dose and high-dose of CNHQX group［(300， 8 and 16 g/kg·d)］and each subgroup contained 10 rats.The rats were respectively orally pretreated with 2 mL)twice for one day， and were injected ip. with a dose of 70 mg/kg of pentylenetetrazole for30 min after the administration after the second time except rats in the normal controlgroup.The convulsive behaviors including the latentperiod， seizure time，seizure score，simultaneous EEG， mortality was observed for 30 min after each injection.The rats in the latter group were divided into 6 sub-groups including the normal control group ， saline control group， diazepam group， low-dose， middle-dose and high-dose of CNHQX group and the administrationsof the drugs in each group was the same as in vivo group.The rats in the brain slice group weremade into brain slices at30min after the administration the second time and the slices were induced by Mg2+free artificial cerebrospinal fluid(ACSF)for the record of field potential of the cortex and CA1 region of the hippocampus including the latent period， and frequency and amplitude of wave.RESULTS CNHQX significantly prolonged the onsetof seizures， delayed the seizure time， decreased the seizure score andmortality and improved the EEG athigh-dose andmiddle-dose(P＜0.01).It also decreased the seizure rate and prolonged the onset of seizures， decreased frequency and amplitude ofwave induced by the Mg2+free artificial cerebrospinal fluid of brain slice in high-dose and middle-dose.CONCLUSION CNHQX has possessed anticonvulsant activity against pentylenetetrazole-induced and Mg2+free artificial cerebrospinal fluid induced seizuresdose dependently in the developing rats.

Child Niuhuang Qingxin Powder(CNHQX)； zeizure； pentylenetetrazole； Mg2+free；infantile rat

R285.5

:A

:1001-1528(2014)02-0244-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.006

2013-06-25

李文娟 (1987—) ， 女， 硕士生， 研究方向: 未成熟脑惊厥性脑损伤与脑保护作用。 Tel:13983467430， E-mail:627775752 @qq.com

*通信作者: 蒋 莉 (1964—) ， 女， 教 授， 研 究 方 向: 小 儿 神 经 系 统 疾 病 基 础 与 临 床。 Tel:(023)63621892， E-mail:dr-jiangli @126.com