新胃乃安片的质量标准研究

梁小银， 林文华， 严 萍， 苏碧茹， 詹若挺， 陈蔚文*

（1 广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心、 岭南中药资源教育部重点实验室， 广东 广州 510006；2.广州白云山中一药业有限公司， 广东 广州 510530）

新胃乃安片的质量标准研究

梁小银1， 林文华1， 严 萍1， 苏碧茹2， 詹若挺1， 陈蔚文1*

（1 广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心、 岭南中药资源教育部重点实验室， 广东 广州 510006；2.广州白云山中一药业有限公司， 广东 广州 510530）

目的 建立新胃乃安片 （黄芪、 三七、 红参、 人工牛黄和珍珠层粉） 的质量标准。方法 采用薄层色谱法对处方中的黄芪、 红参和三七中的多种指标成分进行同时鉴别； 采用薄层色谱法对人工牛黄进行鉴别； 采用 HPLC-ELSD法对方中黄芪的黄芪甲苷进行测定。结果 薄层色谱特征明显，在同一薄层板上能同时鉴别黄芪、红参和三七药材；黄芪甲苷在1.539 ～15.39 μg（r=0.999 8） 范围内呈良好的线性关系， 其平均回收率 （n=6） 为 97.0% （RSD=1.5%）。 结论 建立的薄层色谱和 HPLC定量测定方法简便、 重复性好， 专属性强， 可用于新胃乃安片的质量控制。

新胃乃安片；黄芪；红参；三七；黄芪甲苷；质量标准

胃乃安胶囊是国家中药保护品种，是广东省名老中医梁乃津主任医师的经验方，由黄芪、三七、红参、人工牛黄等组成，具有补气健脾、活血止痛的功能，用于脾胃气虚、淤血阻滞所致的胃痛，症见胃脘隐痛或刺痛、纳呆食少；慢性胃炎、胃及十二指肠溃疡见上述 症候者［1-3］。 其质量标准 现收载于 《中国药典》2010 年版一部。 新胃乃安片为本课题组在保持胃乃安胶囊原处方不变的基础上，以中医药理论为指导，以临床疗效为基础，应用先进的现代中药制剂新工艺、新设备、新技术和新材料对胃乃安胶囊进行二次开发而研制出的新剂型［4］。为有效控制该制剂质量，本研究建立了黄芪、红参、三七以及人工牛黄的薄层色谱鉴别方法和黄芪甲苷的定量测定方法，为制定新胃乃安片的质量标准提供参考依据。

1 仪器与实验材料

1.1 仪器 Waters e2695 高效液相色谱仪： （ 四元泵自动进样系统）， Waters 2424 蒸 发光散 射检测器， Empower化 学 工 作 站 （美 国 沃 特 世 公 司）；Milli-Q超纯水设备 （法国 Millipore公司）； BS224S电子天平 （德国 Sartorius， 万分之一）， XR205SMDR电子天平 （ 瑞士 Precisa， 十万分之 一） ； KQ-700DE型超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）； VISUALIZER薄层色谱数码成像系统 （ 瑞士CAMAG公司）。

1.2 实验材料 黄芪甲苷对照品 （批号 110781-200613）， 三 七 皂 苷 R1对 照 品 （ 批 号 110745-200617），人 参 皂 苷 Rb1对 照 品 （ 批号 110704-201122， 纯度 92.9%）， 人参皂苷 Rg1对照品 （批号 110703-201027， 纯 度 96.3%）， 胆 酸 对 照 品（批号 100078-200414）， 猪去氧胆酸对照品 （批号100087-200610， 纯 度 97.3%）， 黄 芪 对 照 药 材（膜荚黄芪， 批号 121462-201003）， 红参对照药材（批 号 121045-200503 ）， 三 七 对 照 药 材 （ 批 号120941-200506）， 人 工 牛 黄 对 照 药 材 （ 批 号121197-200502）， 以上对照物质均来源于中国药品生物制品检定所。新胃乃安片中试样品 （批号20101002、 20110301、 20110302） 由广州白云山中一药业有限公司提供；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 黄芪、红参、三七的鉴别 取本品适量，研细， 取 2 g， 加甲醇 50 mL， 超 声处理 30 min，滤过， 滤液蒸干， 残渣加水 20 m L， 微热使溶解，用乙酸乙酯振摇提取 3 次， 每次 30 m L， 取下层水液， 用水饱和正丁醇振摇提取 3 次，每次 30 mL，合并正丁醇液， 用氨试液洗涤 2 次，每次 30 mL，弃去氨液， 正丁醇液蒸干， 残渣加甲醇 0.5 mL使溶解， 作为供试品溶液。 取黄芪对照药材2 g， 加甲醇50 mL， 同法制得黄芪对照药材溶液。 取红参对照药材 0.5 g与三七对照药材 0.7 g， 分别加水100 mL， 煎煮1 h， 滤过， 滤液分别用乙酸乙酯振摇提取 3 次， 每次 30 m L， 弃去乙酸乙酯液， 自“用水饱和正丁醇振摇提取”起，同法分别制得红参、三七对照药材溶液。另取黄芪甲苷对照品、人参皂苷 Rg1、 人参皂苷 Rb1及三七皂苷 R1对照品，加甲醇制成每1 m L各含1 mg的混合对照品溶液。再分别取相当量的黄芪阴性样品和红参、三七双阴性样品，分别同法制得黄芪阴性对照溶液及红参、三七双阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、各阴性对照溶液及对照品溶液各2 μL、黄芪对照药材溶液 10 μL、 红参对照药材溶液6 μL、 三七对照药材溶液1 μL， 分别点于同一硅胶 G薄层板上， 以正丁醇-乙酸乙酯-稀氨 （5→50）（4 ∶1 ∶5） 上层溶液为展开剂， 置用浓氨试液预饱和 20 min 的展开缸内，展开， 取出， 晾干， 喷以10%硫酸乙醇溶液， 在 105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置紫外光灯（365 nm） 下检视， 显相同颜色的荧光斑点， 黄芪阴性、红参、三七双阴性对照均无干扰， 见图1。

2.1.2 人工牛黄的鉴别 取本品适量， 研细， 取0.2 g， 加甲醇 20 mL， 超声处理 30 min， 滤过， 滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解， 作为供试品溶液。 取人工牛黄对照药材 10 mg，置 5 mL具塞试管中， 加甲醇 2 mL， 超声处理 10 min， 离心， 取上清液作为对照药材溶液。另取胆酸对照品、猪去氧胆酸对照品， 分别加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再取相当量的人工牛黄阴性样品，同法制得人工牛黄阴性对照溶液。照薄层色谱法试验， 吸取上述溶液各 1 μL， 分别点于同一硅胶 G薄层板上， 以环己烷-乙酸乙酯-甲醇-乙酸 （20 ∶25 ∶3 ∶2）的上层溶液为展开剂， 展开，取出， 晾干， 喷以 10%硫酸乙醇溶液， 在 105 ℃加热至斑点显色清晰， 置紫外光灯 （365 nm） 下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰， 图2。

图1 新胃乃安片中黄芪、红参、 三七的薄层色谱鉴别图Fig.1 TLC chromatogram s of Astragali Radix， Ginseng Radix et Rhizome Rubra and Notoginseng Radix in Xin W einaian Tablets

2.2 样品中黄芪甲苷测定

2.2.1 色谱条 件 Ecosil-C18色 谱柱 （250 mm× 4.6 mm， 5 μm）； 流动相为乙腈-水 （30 ∶70）； 柱温 30 ℃； 体积流量 1.0 mL/min； 用蒸发光散射检测器检测， 漂移管温度 55 ℃， 载气体积流量30 psi（1 psi=6.895 kPa）， 增益值 200。

图2 新胃乃安片中人工牛黄的薄层色谱鉴别图Fig.2 TLC chromatogram of Calculus bovis factitius in Xin W einaian Tablets

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品 10.26 mg，置 20 mL量瓶中， 加甲醇溶解并稀释至刻度， 摇匀， 制得质量浓度为 0.513 mg/mL的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品 10 片， 精密称定， 研细，取粉末约 1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中， 精密加入甲醇 50 mL， 密塞， 称定质量，超 声 处 理 （ 频 率 为 40 kHz，功 率 为 280 W）30 min， 取出， 放冷， 再称定质量， 用甲醇补足减失的质量， 摇匀， 滤过， 精密量取续滤液 25 mL，蒸干， 残渣加水 20 m L， 微热使溶解， 用水饱和正丁醇振摇提取 4 次， 每次 40 mL， 合并正丁醇液，用氨试液洗涤 2 次， 每次 40 mL， 弃去氨液， 正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 摇匀， 用 0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 专属性试验 按新胃乃安片处方、 制法制得缺黄芪药材的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制得黄芪阴性对照溶液。取新胃乃安片供试品溶液与黄芪阴性对照溶液各 20 μL及黄芪甲苷对照品溶液 15 μL， 注入液相色谱仪， 按 “2.2.1” 项下的色谱条件测定。结果黄芪阴性对照溶液对试验无干扰，见图3。

图3 黄芪甲苷专属性试验 HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatogram s of astragaloside IV in Xin W einaian Tablets

2.2.5 线性关系、 定量限及检测限考察 分别精密吸取 “2.2.2” 项下的对照品溶液 （质量浓度为0.513 mg/m L） 3、 5、 10、 15、 20、 25、 30 μL注入液相色谱仪中， 各进样 2 针， 按 “2.2.1” 项下的色谱条件测得峰面积，以峰面积的自然对数Y为纵坐标，以进样量的自然对数X为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归计算，得标准曲线回归方程 Y=1.698X+9.492， r=0.999 8。 结果表明黄芪甲苷进样量在 1.539 ～15.39 μg范围内的自然对数值与峰面积自然对数值呈良好的线性关系。此外，分别将黄芪甲苷对照品溶液稀释至一定浓度，按 “2.2.1” 项下的色谱条件进行测定， 以信噪比为 10 ∶1 时， 计算出定量限为 1.539 μg； 以信噪比为 3 ∶1 时， 计算出检测限为 0.769 5 μg。

2.2.6 重复性试验 取同一批号质量差异项下的供试品 （ 批号： 20110301） 共 6 份， 每份 1.5 g，精密称定， 按 “2.2.3” 项下的方法平行制备测定， 测得结 果 分 别 为 1.35、 1.35、 1.31、 1.34、1.32、 1.34 mg/片，平 均 含 有 量 （ n=6 ） 为1.34 mg/片， RSD为 1.2%。

2.2.7 日内精密度试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液15 μL， 按 “2.2.2”项下的色谱条件， 连续 进 样 6 次，记 录 峰 面 积 分 别 为 440 835、440 143、 437 027、 439 880、441 029、 437 695，平均值为 439 434.8， RSD为 0.4%。

2.2.8 日间精密度试验 取同一重复性试验项下的供试品溶液， 连续进样3 d， 每天进样2次， 结果为第 1 天 1.37 mg/片， 第 2 天 1.36 mg/片， 第 3天 1.36 mg/片， 平均含有量为 1.36 mg/片， RSD为 0.4%。

2.2.9 稳定性试验 取同一重复性试验项下的供试品溶液分别于 0、 2、4、 8、 16、24 h 进样测定，测得峰面积分别为 338 397、 346 021、347 572、349 977、 354 243、 338 397， 平均值为 345 768，RSD为 1.8%， 表明供试品 溶液在 24 h 内基本稳定。

2.2.10 加样回收率试验 精密称取上述已知含有量的新胃乃安片供试品 （批号 20110301） 0.75 g，共6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入黄芪甲苷对照品溶液 （质量浓度为 1.681 mg/mL） 1.0 mL，按上述方法平行制备测定，计算回收率，结果见表1。

表1 黄芪甲苷的加样回收率试验结果Tab.1 Results of recovery tests for astragalosideⅣ

2.2.11 样品测定 取 3 批供试品，每批平行 3份， 按上述方法制备测定，结果见表2。

表2 新胃乃安片中黄芪甲苷的测定结果Tab.2 Content of astragaloside IV in Xin Weinaian Tablets

3 讨论

3.1 黄芪、 红参、 三七的薄层鉴别 《中国药典》 2010 年版一部胃乃安胶囊项下质量标准中皂苷类成分的鉴别只有三七中的三七皂苷 R1， 然而只对单一指标成分进行控制，远远不能达到有效控制中药制剂质量的目的［5］。由于黄芪、红参、 三七为胃乃安胶囊发挥药效的主要药味，三者含有的皂苷类成分均为其主要有效成分，且结构相似，因此本研究设计在同一色谱中同时鉴别黄芪中的黄芪甲苷、 红参和三七中的人参皂苷 Rg1、 Rb1和三七皂苷 R1， 以求建立符合现代中药制剂质量控制——多指标成分控制模式的鉴别方法。本研究曾比较了不同的展开系统： ①三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水 （15 ∶40 ∶22 ∶10） 10 ℃下层溶液［1，6］； ②三氯甲烷-甲醇-水 （13 ∶7 ∶2） 10 ℃下层 溶液［1，7-8］；③正丁醇-乙酸乙酯-稀氨 （5→50） （4 ∶1 ∶5） 上层溶液 （展开前，另槽加浓氨试液预饱和20 min）［9-10］。 结果展 开剂 ① 色谱的各主 斑 点的 Rf值较小，且黄芪甲苷与人参皂苷 Rg1斑点分离度达不到要求；展开剂②的黄芪甲苷与人参皂苷 Rg1斑点也分不开； 而展开剂③色谱各斑点 Rf值适中，斑点清晰，分离度好；另外还比较了展开剂③在展开前，不加浓氨试液预饱和以及将展开剂③的稀氨（5→50） 改为水， 展开前同样不加浓氨试液预饱和 （即展开剂④： 正丁醇-乙酸乙酯-水 （4 ∶1 ∶5）上层溶液［11-12］） ， 结果发现展开剂③展开前加 浓氨试液预饱和的色谱各主斑点 Rf值较不加浓氨试液预饱和的稍高，且较展开剂④斑点集中，分离度好； 因此最终选择展开剂③正丁醇-乙酸乙酯-稀氨（5→50） （4 ∶1 ∶5） 上层溶液 （展开前， 另槽加浓氨试液预饱和 20 min）作为本研究的展开剂。此外，由于制剂中黄芪、三七及红参均为水煮提取，因此为了与供试品制备方法同步，对照药材的前处理理应均采用水煮法，按本方量折算黄芪对照药材应取7 g， 红参对照药材取 0.5 g， 三七对照药材取0.7 g，本研究比较了黄芪对照药材取7 g水煮与黄芪对照药材取2 g甲醇超声，结果二者色谱行为基本一致，考虑到黄芪对照药材取7 g成本较高，给日后标准的执行增加困难，因此选择黄芪对照药材取2 g甲醇超声提取，另由于红参、三七对照药材取样量较少，因此采取水煮法提取。

3.2 成分测定 新胃乃安片是在保持胃乃安胶囊原处方量不变的基础上制得，以黄芪作为君药，投料量较大，其中黄芪甲苷为其药理活性主要物质之一， 具有免 疫 调 节、 抗 炎 等 方 面 的 作 用［13-14］， 因此采用 HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷的量作为本制剂的质 量控 制 指 标［15-16］。 在样 品 前 处理 时，曾 比较了以甲醇、乙醇和正丁醇为溶剂的超声提取，以正丁醇超声后氨试液洗涤提取，以甲醇超声后正丁醇萃取氨试液洗涤提取，结果为甲醇超声后正丁醇萃取氨试液洗涤提取的黄芪甲苷量最高，且发现有氨试液洗涤后提取的黄芪甲苷量远远高于无氨试液洗涤提取的；另外还考察了正丁醇的萃取次数以及氨试液洗涤次数，结果显示以正丁醇萃取4次（每次40 mL） 和氨试液洗涤 2 次 （每次 40 mL）的效果最佳，该结果也与胃乃安胶囊质量标准中黄芪甲苷定量测定的提取方法相符。

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Quality standard for Xin W einaian Tablets

LIANG Xiao-yin1， LINWen-hua1， YAN Ping1， SU Bi-ru2， ZHAN Ruo-ting1， CHENWei-wen1
（1.Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering， Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Key Laboratory of ChineseMedicinal Resource from Lingnan， Ministry of Education， Guangzhou 510006， China； 2.Guangzhou Zhongyi Baiyunshan Pharmaceutical Company Limited， Guangzhou 510530， China）

Xin Weinaian Tablets； Astragali Radix； Ginseng Radix et Rhizome Rubra； Notoginseng Radix；astragaloside；quality standard

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）05-0990-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.023

2013-10-10

粤港关键领域重点突破招标项目 （GDDRC2007ZY002）

梁小银 （1986—） ， 女， 硕士。 Tel： 18900868019， E-mail： lxyin2006@163.com

*通信作者： 陈蔚文 （1950—） ， 男， 教授， 博士生导师。 E-mail： chenww@gzucm.edu.cn