三丁基锡和微囊藻毒素对小鼠肝脏p-Ezrin的影响

孙玉涛应琳琳张亚莉徐立红

(1. 浙江大学医学院生物化学系, 杭州 310058; 2. 南通大学医学院, 南通 226000)

三丁基锡和微囊藻毒素对小鼠肝脏p-Ezrin的影响

孙玉涛1应琳琳1张亚莉2徐立红1

(1. 浙江大学医学院生物化学系, 杭州 310058; 2. 南通大学医学院, 南通 226000)

埃兹蛋白(Ezrin)是连接细胞膜和细胞骨架之间的膜细胞骨架连接蛋白, 通过其C端、N端分别与细胞骨架和细胞膜蛋白结合, 属于 ERM (Ezrin-radixin-moesin)家族成员。由于Ezrin在细胞中的特殊位置, 不仅在细胞的运动、黏附等正常生理活动中起重要作用, 而且能调控黏附分子, 参与癌细胞信号转导。

Ezrin在细胞中有活化和失活两种状态, 目前认为主要是通过磷酸化和脱磷酸化调节。磷酸化作用能够激活Ezrin, 打开其空间构象, 暴露结合位点, 进而发挥其功能。而对Ezrin脱磷酸化可使其恢复原来状态, 使结合位点再次遮蔽。Ezrin在肿瘤发展、浸润和转移过程中起重要作用, 如埃兹蛋白在小儿骨肉瘤和横纹肌肉瘤的转移中起重要作用[1,2], 因此 Ezrin有望成为恶性肿瘤预后判断的生物标记物[3—5]。

Ezrin的脱磷酸化由蛋白磷酸酶 2A(Protein phosphatase 2A, PP2A)催化, 可使其处于失活状态[6], 引起Ezrin定位及细胞骨架结构的改变, 最终导致细胞运动性的改变。水污染物微囊藻毒素LR(Microcystin-LR, MCLR)是一种极强的PP2A抑制剂, 研究发现它对PP2A的抑制可以引起细胞中与 PP2A相关的信号通路及细胞骨架的改变[7—11], 同时还发现水污染物三丁基锡(Bributyltin, TBT)也对小鼠组织与FL细胞中的PP2A有明显的抑制作用并同时引起PP2A相关信号通路的改变[12—14]。

其中MCLR和TBT是目前存在较为广泛的水污染物,进入水体后, 易在食用水生生物体内蓄积, 对水生生物具有一定的毒性, 一旦被人食用, 会对人类健康构成潜在威胁[15],可以诱发肝毒性并且与人群中的肝癌发生密切相关[16]。

作为PP2A作用的底物, 当外源性物质影响PP2A后p-Ezrin水平极有可能改变并影响其功能, 因而p-Ezrin有望成为一种生物标志物用于预测外源性物质对生物的可能危害。鉴于MCLR和TBT的广泛毒性尤其是对哺乳动物的免疫和肝毒性效应[17—19], 本研究初步研究MCLR和TBT对小鼠肝脏Ezrin及p-Ezrin表达的影响, 对于探讨建立一项新生物标志物有重要的参考意义。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

TBT-Cl 购自美国 Acros公司, 为无色液体, 纯度90%; MCLR购自Sigma 公司; α-tubulin一抗(鼠来源单抗)购自Abcam公司; Ezrin和p-Ezrin(兔来源单抗)购自Cell Signaling公司; 山羊抗兔、山羊抗鼠二抗(红外荧光标记)购自美国LI-COR公司; 硝酸纤维素膜购自BIO-RAD公司; 滤纸购自Whatman 公司; 苯甲基磺酰氟(PMSF)购自加拿大 Sangon Ltd公司, 二硫苏糖醇(DTT)购自美国Amresco公司; 其余试剂均为市售分析纯。仪器主要包括Synergy HT酶标仪(Bio-Tek公司, 美国); 超低温冰箱(Thermo公司, 美国)等。

1.2 动物分组和处理

从浙江省医科院动物实验中心购进健康雄性 ICR小鼠, 体质量(22 ± 1) g, 在浙江大学医学院动物实验中心饲养, 饲养条件为(24 ± 1) , ℃ 自由饮食, 昼夜光暗周期12h/12h, 实验前观察饲养 3d。TBT染毒的小鼠, 剂量分别为10、20、60 mg/kg, 对照组用溶剂玉米油灌胃, 每组3只, 灌胃24h后, 颈椎脱臼处死小鼠。迅速取其肝脏组织, 并用预冷的生理盐水清洗, 分装后迅速放入液氮速冻, 置于–70℃冰箱冷冻保存备用。

MCLR先溶于少量 DMSO, 再用水稀释至所需的浓度, 腹腔注射染毒, 注射体积为 10 µL/g(DMSO浓度＜0.19 mg/mL)。每组 20只小鼠, 剂量分别为 0 µg/kg, 40 µg/kg, 60 µg/kg, 80 µg/kg, 腹腔注射后分别在6h、12h、24h取样。颈椎脱臼处死小鼠后小心分离肝脏组织, 用冷生理盐水清洗, 置于–70℃保存备用。

1.3 组织蛋白的提取

冰上称取约0.1 g组织块, 加入1.5 mL组织裂解液(Tris-Cl 0.6057 g, NaCl 0.8766 g, EDTA 0.3722 g, TritonX-100 0.5 mL), 置于冰上充分匀浆后, 12000 g, 10min, 4℃离心, 收集上清。Bradford法测蛋白浓度, 样品按每管60 µg分装后于–70℃保存备用。

1.4 Western blot 技术检测Ezrin及p-Ezrin表达水平

Western blot步骤参照《分子克隆实验指南第二版》[20]略加修改(封闭液用 5%牛血清白蛋白, 二抗用红外荧光标记二抗), 一抗和二抗稀释比参照抗体说明书。孵好二抗的硝酸纤维素膜, TBST清洗未结合的二抗后, 于Odyssey红外荧光扫描成像系统扫描荧光强度。

Quantity one 图像分析软件分析各条带灰度值, 结果以各目的条带和内参的灰度值比值表示。

1.5 统计分析

数据分析采用SPSS 17.0统计软件, 单因素方差分析(ANOVA), 以P ＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 MC-LR 对Ezrin 表达的影响

分别用40、60、80 µg/kg MC-LR处理小鼠, 检测处理24h后, 各处理组Ezrin和p-Ezrin的变化。随着染毒浓度的增加, Ezrin的表达量并没有明显变化, 而p-Ezrin的水平有明显上升趋势, 并呈现浓度依赖性。(图1)

2.2 TBT 对Ezrin 表达的影响

小鼠经0、10、20和60 mg/kg TBT染毒24h后, 肝脏 Ezrin的表达与对照组相比并未发生明显改变, 而p-Ezrin的水平与对照组相比在10、20和60 mg/kg浓度处有明显增加, 并呈现浓度依赖性(图2)。

图1 MCLR不同处理组小鼠肝脏中Ezrin和p-Ezrin蛋白水平(n=3, *P＜0.05)Fig. 1 Ezrin and p-Ezrin protein level in mouse liver exposed to MCLR (n=3, *P＜0.05)

图2 TBT不同处理组小鼠肝脏中Ezrin和p-Ezrin蛋白水平(n=3, *P＜0.05)Fig. 2 Ezrin and p-Ezrin protein level in mouse liver exposed to TBT (n=3, *P＜0.05)

3 讨论

Ezrin在细胞中的活化和失活两种状态与 Ras、Rho信号途径, AKT、MAPK等信号通路密切相关。而MCLR作为一种PP2A的抑制剂, 进入细胞后, 不仅能强烈抑制丝/苏氨酸蛋白磷酸酶 PP2A的活性[21], 同时能够通过其对PP2A的抑制作用调控MAPK、Akt等信号通路。同时, TBT也能抑制PP2A活性并干扰MAPK、Akt等信号通路。

在本实验中MCLR与TBT都引起了p-Ezrin的升高,活性增强, 而Ezrin活性的变化可能影响组织细胞内正常的生理功能。这一过程可能是通过抑制 PP2A, 也有可能是通过干扰MAPK、Akt等信号通路或者伴有其他通路的激活, 形成细胞内信号调控的复杂网络式反应。而目前对Ezrin相关信号通路的作用机制尚未完全阐明, 或有新的功能、机制尚未发现, 更重要的是其上游表达调控尚未阐明。因此, 本实验后续的工作将增加对 PP2A酶活和MAPK、Akt等信号通路相关蛋白的检测, 研究MCLR和TBT染毒后, PP2A以及MAPK, Akt等信号通路是否参与到Ezrin活性的调控中, 以期更深入地研究Ezrin 对细胞信号通路及胞内正常生理功能的影响。这不仅对 MCLR和 TBT肝毒性机制的研究提供了一个新的方向, 也为发展p-Ezrin为一项新生物标志物提供了重要依据。

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EFFECT OF TBT AND MICROCYSTIN-LR ON P-EZRIN LEVEL IN MOUSE LIVER

SUN Yu-Tao1, YING Lin-Lin1, Zhang Ya-Li2and XU Li-Hong1
(1. Department of Biochemistry, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2. School of Medicine of Nantong University, Nantong 226000, China)

微囊藻毒素LR; 三丁基锡; 磷酸化埃兹蛋白; 生物标志物

MCLR; TBT; p-Ezrin; Biomarker

X171.5

A

1000-3207(2014)01-0197-03

10.7541/2014.28

2012-07-28;

2013-04-12

国家自然科学基金81172703资助

孙玉涛(1988—), 男, 山东莒县人; 硕士; 主要从事环境毒理研究。E-mail: syt2006dxx@126.com

徐立红, E-mail: xulihong@zju.edu.cn