改良差异裂解法结合硅珠法提取混合斑精子DNA

韩海军，张玉红，杨敏，伊海，杨耕野，贾东涛，卢大儒

（1.复旦大学生命科学学院，上海200433；2.南通市公安局物证鉴定所，江苏南通226007）

在性犯罪案件中，含有精液和女性成分混合斑是常见的生物检材物证。一般先采用差异裂解法[1]消化女性成分，但在实际检案中发现，因有些混合斑中的精子数量少或女性成分难以消化完全，常检出混合基因型或女性DNA分型。2006年李鑫等[2]利用单细胞捕获法、2009年邵武等[3]利用过滤膜法分离精子细胞取得了良好效果。本研究收集52例混合斑样本，按常规差异裂解法和硅珠法提取精子DNA，检测图谱含有女性STR分型，经采用改良差异裂解法结合硅珠法提取，以提高混合斑检材中精子DNA分型有效检出率。

1 材料与方法

1.1 样本

52例经常规差异裂解法[1]检验结果含有女性分型的混合斑检材来自于本实验室日常受理的案件，其中阴道拭子21例、内裤26例、卫生巾5例。

1.2 主要试剂和仪器

P30金标试纸条（北京芬格尔安公司），硅珠法试剂按文献[4]配制，IdentifilerTM试剂盒、9700扩增仪、3130XL型遗传分析仪（美国AB公司）。

1.3 方法

1.3.1 确证实验

分别剪取混合斑样本少量，浸泡后离心，取上清液分别经P30金标试纸条检测，均呈阳性反应。取沉淀少量涂片、酸性品红亚甲基蓝染色，高倍镜下有8例检见1~3个精子/每视野，44例未检见精子，52例均检见大量阴道上皮细胞。

1.3.2 精子分离

改良差异裂解法：分别剪取内裤布片约2cm×2cm，卫生巾外层纸约2cm×2cm，阴道拭子1枚（取外层棉花），剪碎后置入2mL试管中，加入1.6mL TES、160μL 10%SDS、16 μL PK（10 mg/mL），振荡混匀后置于恒温振荡器56℃保温2h以上，将液体转移至另一2mL试管。以离心半径5cm，12000r/min，离心3min，吸弃上清液，沉淀中加入1.6 mL TES、160 μL 10%SDS、16μL PK，振荡混匀后置于恒温振荡器，56℃再次保温3h以上，以离心半径5cm，12000r/min离心3min，吸弃上清液，沉淀转移至0.5mL试管，用300μL TES漂洗3次后备检。

以上结果与采用常规差异裂解法进行精子分离检验结果进行比较。

1.3.3 精子DNA提取、扩增及检测

在上述含提纯后精子试管内加入100 μL TES、20 μL SLS、4 μL DTT（1 mol/L）振荡混匀后置于恒温振荡器99℃保温5min。在上述消化液中加入吸附液300μL，涡旋混合5s，以离心半径5cm，12000r/min，离心2 min，上清液转移到另一0.5 mL的离心管中。加入20μL硅珠悬液，吸附15min，离心弃上清液。漂洗液洗涤1次，70%乙醇溶液洗涤3次，最后离心弃上清液，60℃挥干乙醇。加入20μL的TC，56℃保温15min，离心后上清液用于PCR反应。

采用IdentifilerTM试剂盒进行复合扩增，PCR体系为10 μL，扩增产物在3130XL型遗传分析仪上进行毛细管电泳，用GeneMapper ID-X软件进行基因分型，混合样本分析按文献[5]方法进行。

2 结果

对比两种分离方法的检验结果，改良差异裂解法男性分型检出率得到了提高，达到98.08%（51例），而常规差异裂解法仅为42.31%（22例）（表1），对常见的内裤、阴道拭子、卫生巾等载体混合斑均有较好适应性（表2）。同一样品用改良方法精子成分峰高比例明显升高（图1）。

表1 两种分离方法检验结果对比 ［例（%）］

表2 3种载体混合斑中精子成分的有效检出率 ［例（%）］

图1 阴道拭子样本的检验图谱

3 讨论

郑秀芬等[5]认为能检出混合样品中少量成分等位基因的最高混合比例为1∶10；在混合比例为1∶20时，基本上检测不出来自少量混合成分的等位基因，表现为单一组分图谱。采用常规差异裂解法检验混合斑中微量精子，检出女性单一型或男女混合型，分析原因可能是女性细胞难以消化完全，微量的精细胞在混合样品中成分低于1∶10，甚至低于1∶20。女性细胞难以消化完全的原因主要是黏附于载体上的女性细胞洗脱效率低以及常规差异裂解液裂解效率低。改良差异裂解法从4个方面加以改良，以提高女性细胞消化效率：检材中加入相应比例TES、SDS、PK，56℃保温振荡，利用温度和SDS的作用增强洗脱效率，进行细胞洗脱的同时进行女性成分初步消化；去除载体，避免载体上难以洗脱的女性细胞进入下一步骤；加入相应比例消化液对女性成分进行二次消化；提高消化温度至56℃，提高消化效率。

本研究选择硅珠法提取微量精子的DNA，原理是在高浓度的硫氰酸胍的存在下，DNA能被硅珠特异性地吸附；去除条件后又可以释放DNA。吸附DNA的硅珠经过多次漂洗可将溶液中的PCR抑制物除去，因此提取的DNA比较纯，回收率高。

综上所述，改良差异裂解法结合硅珠法提高了混合斑中女性成分消化效率，极大程度提高了混合斑中男性分型检出率。此改良方法操作简单、效率高，无需特殊设备且费用低，适用于常见的混合斑检材，在法医物证检案中有较高的应用价值。

[1]Gill P，Jeffreys AJ，Werrett DJ.Forensic application of DNA‘fingerprints’[J].Nature，1985，318（6046）：577-579.

[2]李鑫，胡兰，郭红玲，等.显微操作法提取混合斑中精子细胞方法的探讨[J].中国法医学杂志，2006，21（5）：263-265.

[3]邵武，姜先华，孙学科，等.精子富集柱分离技术的研究[J].中国法医学杂志，2009，24（3）：194-196.

[4]王林生，苏勇，顾林岗.硅珠法提取PCR模板DNA[J].中国法医学杂志，2000，15（1）：36-37.

[5]郑秀芬，纪贵金，刘超，等.二组分混合DNA样品STR图谱解释[J].中国法医学杂志，2000，15（4）：203-207.