不同死因大鼠心肌内多种RNA相对表达量变化与PMI的关系

吕叶辉，张恒，潘晖，马开军，李文灿，陈文峰，江洁清，薛爱民，张萍，王慧君，陈龙

（1.复旦大学上海医学院法医学系，上海200032；2.上海市公安局刑事科学技术研究所法医室，上海200043；3.上海市公安局浦东分局刑事科学技术研究所，上海200135；4.复旦大学附属儿科医院，上海201102）

死亡时间（PMI）是指发现、检查尸体时距死亡发生时的时间间隔，PMI的准确推断具有重要的法医学实践价值，一直是法医病理学研究的重点和难点之一。利用传统的方法进行PMI的推断一直受到各种因素的制约，如环境温度、湿度、机体内在因素等，导致推断的准确性和精确性较低。随着分子生物学技术在法医学领域的广泛应用，利用生物体内RNA的时间依赖性降解规律推断PMI正逐渐成为目前研究的热点。

实时荧光定量PCR作为核酸的精确定量技术，拥有准确、高效的优点，被越来越多地应用于PMI的推断[1-2]，但是目前研究PMI的动物模型较为单一，通常只考虑温度因素的影响，而针对不同死亡原因的研究较少，故实际应用受限[3]。本研究通过构建断颈死、窒息死和失血性休克死的大鼠模型，利用实时荧光定量PCR技术检测各RNA相对表达量与PMI的关系，以期为不同死因下PMI的推断提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

RNAlater保护液（美国Ambion公司），TRIzol试剂盒（美国Invitrogen公司），PrimeScriptTMRT试剂盒（日本TaKaRa公司），SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒（日本TaKaRa公司），DEPC水（焦碳酸二乙酯处理并经高温高压灭菌的MiliQ纯水）。NanoDrop 1000分光光度计（美国Thermo公司），7500型实时荧光定量PCR仪（美国AB公司），geNorm PLUS软件（比利时Biogazelle公司）。

1.2 实验动物分组

成年健康SD大鼠135只，雄性，体质量在250 g左右，由复旦大学上海医学院动物实验中心提供。按照随机的原则将大鼠分为断颈组、窒息组和失血性休克组，每组45只，并将断颈组作为对照。

1.3 动物模型的建立及处理

断颈死模型：用一手拇指和食指用力往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力向后上方拉动，造成脊髓横断致死。

窒息死模型：用直径3mm尼龙绳打一个可滑动的活套，上端固定于横杠上，将大鼠颈部放入活套内并使其背对活结，大鼠依靠自身重力拉紧活套，造成窒息死亡[4]。

失血性休克死模型：采用传统的Wiggers改良法，在大鼠处死前12h禁食，50mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。麻醉后仰卧固定于大鼠板上，分离出右侧股动脉，插入三通管，三通管连接血压计观察血压、连接注射器用于放血，肝素钠500U/kg抗凝。术毕稳定10 min后开始放血，10 min左右血压降至5.3 kPa（40mmHg），维持3h后立即处死大鼠。

尸体保存于室温（25±2）℃的环境下。各组分别在死后0、3、6、12、24、36、48、72、96 h提取大鼠心肌组织（每个时间点5只大鼠），分装于RNAlater保护液中，置于-80℃冻存。

1.4 RNA的提取与cDNA的合成

取冻存组织（约30 mg），按照TRIzol试剂盒总RNA提取说明书操作步骤提取总RNA，NanoDrop 1000分光光度计测定RNA的浓度及纯度，并计算单位质量心肌下RNA得率。取RNA样本500ng进行反转录，按照PrimeScriptTM试剂盒说明书配置10 μL反应体系。反转录条件为37℃15min，85℃5s，1个循环。

1.5 引物的设计与合成

共选择7种RNA指标，分别为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、β-肌动蛋白（β-actin）、缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、U6微核RNA（U6 small nuclear RNA，U6 snRNA）。根据GenBank提供的上述大鼠mRNA序列及U6 snRNA序列设计引物。引物设计除U6 snRNA外至少跨一个外显子或外显子区域以保证目的cDNA的正确合成与扩增，所有引物均选择在RNA序列的3′端附近且经Blast验证，扩增片段长度都在400bp以下。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 选取的指标及引物序列

1.6 实时荧光定量PCR

应用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒进行实时荧光定量PCR反应。按说明书配制20μL反应体系：SYBR®Premix Ex Taq 10μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4 μL、ROX Reference DyeⅡ0.4 μL、cDNA模板1μL、双蒸灭菌水7.8μL。应用7500型实时荧光定量PCR仪进行两步法扩增，扩增条件：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。每个样本重复3次，结果由系统自动生成，从而得到各个指标的循环阈值（threshold cycle，Ct）。

1.7 统计学分析

采用geNorm PLUS软件对7个RNA指标的Ct值进行计算，将基因表达稳定度的平均值M最小的指标作为内对照。各个样本其他RNA指标与选出内对照的Ct差值记做ΔCt，另选取断颈组PMI为0时的样本为对照样本，各样本和对照样本的Ct差值记作ΔΔCt，各指标的相对表达量通过公式2-ΔΔCt计算得到。采用SPSS v18.0软件（美国SPSS公司）进行统计分析，三组间运用单因素方差分析，两组间运用t检验进行差异性分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 总RNA得率及实时荧光定量PCR结果

从135个心肌样本中成功提取总RNA，并加入30 μL DEPC水溶解。经NanoDrop 1000分光光度计测定所有RNA样本的D260/D280在1.8～2.1，且所有D260/D280＞2.0的均在死后36 h，证明RNA纯度和完整性相对较好。单位质量心肌下，断颈组RNA质量为180～340 ng/mg，窒息组为200～330 ng/mg，失血性休克组为160～350ng/mg，三组之间RNA得率差异无统计学意义（P＞0.05）。所有样本均成功反转，对反转后的cDNA进行7个指标的实时荧光定量PCR检测，重复3次，得到Ct值，结果证实扩增曲线和溶解曲线完好，表明样本均成功特异性扩增。

2.2 内对照的选择

采用geNorm PLUS软件对7个指标的Ct值进行统计学处理，得到不同组别的M值，见表2。M值越小，指标的表达水平越稳定，三组中U6 snRNA的M值都是最小的。U6 snRNA表达稳定，受PMI和死亡原因的影响较小，故将其作为内对照。

2.3 不同死因下各RNA相对表达量与PMI的关系

断颈、窒息和失血性休克组均按照1.7项计算公式方式处理，各指标相对表达量与PMI的关系，见表3～8。

表2 各组7个指标M值稳定性评估

表3 GAPDH在各组的相对表达量与PMI的关系（n=5，±s）

表3 GAPDH在各组的相对表达量与PMI的关系（n=5，±s）

注：1）与相同死亡时间断颈组比较，P＜0.05

组别0h3h6h12h24h36h48h72h96h断颈10.985±0.1240.762±0.1260.617±0.0920.522±0.0860.255±0.0920.105±0.0910.076±0.0210.032±0.012窒息1.258±0.1861）2.595±0.3101）3.234±0.3331）5.205±0.5671）3.773±0.3661）1.773±0.1691）1.233±0.2241）0.553±0.0921）0.124±0.063失血性休克1.985±0.2591）1.986±0.2591）2.801±0.4351）2.381±0.5151）2.052±0.2451）1.321±0.1331）0.558±0.0761）0.222±0.1351）0.090±0.075

表4 β-actin在各组的相对表达量与PMI的关系（n=5，±s）

表4 β-actin在各组的相对表达量与PMI的关系（n=5，±s）

注：1）与相同死亡时间断颈组比较，P＜0.05

6h12h24h36h48h72h96h组别0h3h断颈10.850±0.1240.813±0.126 0.635±0.1920.455±0.0860.239±0.0920.154±0.0910.097±0.051 0.055±0.035窒息0.858±0.250 0.874±0.1870.763±0.176 0.333±0.1631）0.203±0.0851）0.183±0.0460.119±0.0600.084±0.060 0.024±0.013失血性休克1.205±0.300 0.800±0.1500.721±0.170 0.380±0.1401）0.302±0.0951）0.233±0.0630.171±0.0760.109±0.062 0.050±0.035

表5 HIF-1在各组的相对表达量与PMI的关系（n=5，±s）

表5 HIF-1在各组的相对表达量与PMI的关系（n=5，±s）

注：1）与相同死亡时间断颈组比较，P＜0.05；“-”代表未测到

组别0h3h6h12h24h36h48h72h96h断颈11.120±0.1240.813±0.1260.635±0.0920.355±0.0860.239±0.0920.154±0.051--窒息1.216±0.1261）1.415±0.2871）1.316±0.1761）0.986±0.0631）0.803±0.0851）0.723±0.0461）0.419±0.0601）0.084±0.0300.034±0.013失血性休克1.535±0.2151）1.773±0.1001）2.129±0.1701）1.725±0.1401）1.355±0.0951）0.875±0.0631）0.512±0.0761）0.109±0.0420.050±0.015

表6 iNOS在各组的相对表达量与PMI的关系（n=5，±s）

表6 iNOS在各组的相对表达量与PMI的关系（n=5，±s）

注：1）与相同死亡时间窒息组比较，P＜0.05；“-”代表未测到

组别0h3h6h12h24h36h48h72h96h断颈---------窒息11.215±0.0871.982±0.1761.458±0.0631.850±0.2850.592±0.0460.359±0.0600.184±0.0600.083±0.033失血性休克1.893±0.2581）2.573±0.2201）2.129±0.1701.725±0.1401.655±0.0950.875±0.0630.212±0.1760.221±0.062 0.240±0.0351）

表7 TNF-α在各组的相对表达量与PMI的关系（n=5，±s）

表7 TNF-α在各组的相对表达量与PMI的关系（n=5，±s）

注：1）与相同死亡时间断颈组比较，P＜0.05

组别0h3h6h12h24h36h48h72h96h断颈10.858±0.1211.126±0.2550.759±0.1950.659±0.1460.718±0.2660.346±0.1010.226±0.0940.113±0.085窒息1.512±0.1261）1.215±0.3871）1.982±0.1761）1.458±0.0631）1.850±0.2851）0.592±0.0460.359±0.0600.184±0.0600.083±0.033失血性休克4.589±0.3251）3.120±0.2201）3.570±0.5701）2.725±0.1401）1.655±0.5951）0.875±0.0630.212±0.1760.221±0.0620.240±0.035

表8 IL-6在各组的相对表达量与PMI的关系（n=5，±s）

表8 IL-6在各组的相对表达量与PMI的关系（n=5，±s）

注：1）与相同死亡时间断颈组比较，P＜0.05；“-”代表未测到

组别0h3h6h12h24h36h48h72h96h断颈10.883±0.121 0.822±0.2550.723±0.1250.455±0.1250.315±0.2660.106±0.122--窒息1.212±0.1261）1.315±0.3871）1.082±0.1761.858±0.5631）0.850±0.2851）0.392±0.0460.259±0.0601）0.184±0.0730.123±0.033失血性休克2.580±0.3251）3.120±0.2201）1.570±0.5701）1.725±0.1401）1.355±0.5951）0.675±0.0631）0.512±0.2761）0.325±0.0620.100±0.135

GAPDH的相对表达量在断颈组随PMI延长呈逐渐下降趋势，24h约为0h的0.5倍；窒息组相对表达量在12h达到峰值，此后随PMI延长不断下降，在72h内均高于断颈组（P＜0.05）；失血性休克组变化趋势与窒息组相似，但峰值出现在6h，各时间点相对表达量较窒息组低（P＜0.05），但较断颈组高（P＜0.05）。

β-actin的相对表达量在三组中均随着PMI延长不断下降，各时间点变化基本一致，几乎不受死亡原因的影响。

HIF-1的相对表达量在断颈组随PMI延长逐渐下降的趋势，在72h后已检测不出；窒息组HIF-1相对表达量的峰值出现在3 h，约为对照0 h的1.4倍，此后随PMI延长不断降低，在48 h前略高于断颈组（P＜0.05）；失血性休克组在24h前均处于高水平表达，峰值出现在6 h，约为对照0 h的2.1倍，此后HIF-1的相对表达量逐渐降低。

iNOS的相对表达量在断颈组各个时间点均检测不出，故将窒息组0 h样本作为对照；窒息组和失血性休克组在24h前表达水平均增高，峰值分别出现在6h和3h，36h之后相对表达量逐渐降低；失血性休克组在0h和3h较窒息组相对表达量增高（P＜0.05）。

TNF-α的相对表达量在断颈组36h前保持相对稳定，此后不断下降；窒息组的峰值出现在6 h，约为对照0 h的2倍，其在24 h前都保持较高的表达；失血性休克组的峰值出现在死后即刻（0 h），约为断颈组的4.6倍，之后相对表达量随PMI延长不断降低，但在24h前表达水平都高于对照0h（P＜0.05）。

IL-6的相对表达量在断颈组随PMI延长而降低，在72h后检测不到；窒息组在12 h达到峰值，约为对照0h的1.9倍，此后IL-6的相对表达量逐渐降低；失血性休克组在24 h前都处于高表达状态（P＜0.05），在3 h达到峰值，约为对照0 h的3.1倍，此后逐渐降低。

3 讨论

近年来随着分子生物学的发展，利用生物体内大分子如DNA、RNA和蛋白质等来推断PMI是当前研究的热点，尤其是依据RNA的时间依赖性推断PMI已经取得了一定进展[5]。但是目前对RNA推断PMI的研究主要停留在动物模型上，通常的处死方式为断颈死，而针对其他不同死因的研究较少。本研究在将断颈死动物模型作为对照的基础上，探讨了窒息和失血性休克这两种较常见的死因对死后特定RNA表达量的影响，而模型的成功建立是研究死因对PMI影响的前提。窒息死采用了缢死的动物模型，大鼠在套上活套后6min内死亡，尸僵出现较早，与文献[4]报道一致。失血性休克模型在经典的Wiggers改良法基础上，降压稳定后维持3h，以模拟失代偿期的失血性休克即不可逆性休克。多种死因下的研究可以提高PMI推断的灵敏度和精确度，从而增加其实际应用价值。

实时荧光定量PCR技术在检测基因表达水平时有很好的灵敏性与特异性，与传统的半定量RT-PCR技术相比，具有高效稳定的优点，利用Ct值与起始模板浓度的对数呈反比关系来计算RNA的表达水平，可有效避开平台反应带来的误差，是理想的定量技术。主要影响其结果的两大因素是人为操作误差和内对照的选择。因此在每个样本重复3次以减小误差的基础上，内对照的选择对RNA表达的准确定量是至关重要的。geNorm PLUS软件是选择内对照的良好工具，被广泛应用于基因表达的分析[6]。该软件可以计算基因平均表达稳定度，并对所有候选内对照的表达稳定性进行排序。本研究选取的7个指标中，U6 snRNA的M值在3个组别中都是最小的，说明其受死亡原因和PMI的影响都相对较小，与人体心肌组织中的研究结果[7]一致。U6 snRNA是核内小RNA，长度只有100~200bp，只存在于细胞核内，通常状态snRNA不是游离存在，而是与蛋白质结合成复合物，形成小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoprotein particle，snRNP），这为U6 snRNA提供了一个相对稳定的环境，接触核酶的机会较少，不易受内外环境的影响而降解[8]。U6 snRNA在生物体内表达稳定而且高度保守，是理想的内对照，可用其排除个体差异带来的误差，使统计结果更加客观、准确。

利用U6 snRNA作为内对照，计算出各个指标在不同PMI下的相对表达量，其随死因的不同呈现出特异性的改变。在死亡24h之前，断颈组各指标皆呈现缓慢下降的趋势，而窒息组和失血性休克组的各指标（除β-actin）呈现不同程度的增高趋势；在死亡24 h之后，各指标不论组别都随着PMI延长而不断降低，这说明在死亡早期时间内，体内RNA的转录表达并没有停止，而是随着死因的不同而呈现不同的改变，之后细胞彻底死亡，随着核酶持续释放，RNA时序性的降解，各指标相对表达量随着PMI延长不断降低。

GAPDH和β-actin是管家基因，在体内呈高丰度且稳定的表达，是普通分子生物学实验定量mRNA表达时常用的内对照[9]。本研究发现β-actin在3个组内表达几乎没有差异，均随着PMI不断降低。这说明β-actin作为细胞骨架的基本成分，受死因的影响较小，但与PMI的线性关系良好，可作为推断PMI的指标。而各时间点下GAPDH的相对表达量表现为窒息组＞失血性休克组＞断颈组，说明缺氧会引起GAPDH表达上调，而且窒息造成的缺氧程度要比失血性休克造成的缺氧更为严重。GAPDH作为糖酵解的关键酶在缺氧情况下表达上调，可提高葡萄糖的利用率和转运利用，以补偿缺氧时ATP的下降，从而改善缺氧时的能量代谢过程[10]。在死亡模型下，虽然机体已经死亡，但是组织细胞仍能保持一定的生物活性，故细胞依然能感受缺氧的状态，在死亡早期GAPDH可不断增高。

HIF-1是受缺氧诱导的关键因子，在通常状态下其α亚基通过泛素-蛋白酶体系迅速降解，但在缺氧状态下HIF-1 α亚基降解受阻聚集，有报道[11]称其早期调节主要通过蛋白转录后水平而不是通过mRNA的转录水平增加表达。本研究证实HIF-1在窒息组表达增高不明显，峰值出现在死后3h且只有对照0h的1.4倍，与张更谦等[4]的研究一致，推测是窒息造成的缺氧状态并不能刺激心肌细胞RNA转录的升高，而是在蛋白水平有所增高。HIF-1在失血性休克组在24 h前均处于高表达水平，这与我们采用的模型有关，即降压稳定后维持3h，失血性休克已达到失代偿期即不可逆性期。有研究[12]表明，HIF-1在严重失血性休克中参与了能量代谢、炎症反应失控和脂质过氧化损伤的途径，而不是单纯的缺氧，故其可能在死后一定时间内呈现出转录水平的增高。

iNOS在基本状态下不表达或者表达量很低，但在缺氧、损伤、炎症介质、内毒素等因素刺激下，编码基因被激活，可在一定时间内持续表达mRNA[13]。在断颈组iNOS均检测不到表达，在窒息组和失血性休克组24 h前持续表达增高，说明缺氧可以导致iNOS成倍表达增加。失血性休克组在3h前较窒息组表达增高，可能是重症失血性休克组除了缺血缺氧之外，已经有全身不同程度的全身炎症反应发生，而iNOS正是促炎反应的核心分子。

TNF-α和IL-6作为体内重要的细胞因子，介导参与体内多种生物学反应，如抗肿瘤和调节机体免疫功能等，同时在失血性休克中促进着炎症的发生，也被称为促炎细胞因子[14-15]。正常情况下，单核巨噬细胞内含有少量TNF-α的mRNA，受炎性刺激能快速上调mRNA表达。本研究发现，在单纯的窒息缺氧下，TNF-α表达也可以上调且窒息组的峰值出现在HIF-1峰值之后，推测是作为HIF-1的下游因子，TNF-α可在缺氧状态下被诱导而表达增高，与余娴[14]的研究一致。在失血性休克组，TNF-α在0h已处于最高峰，且高于窒息组，Yao等[15]认为，失血性休克发生30 min TNF-α水平已经开始升高，其可能是炎症介质连锁反应中最早的启动因子，故在死后0h已达到高峰。IL-6是一种重要的急性反应期炎症介质，多在受到TNF-α刺激后产生，同时也可以对TNF-α进行反馈调节，调控网络相对复杂[15]。IL-6在窒息组和失血性休克组的峰值皆晚于TNF-α出现，推测其可能是随着TNF-α的上调而增高。

用一种死亡模型来推断PMI，可用的指标就会比较少，相应推断的精确度也会降低，因此推广应用受到限制。在窒息和失血性休克状态下，体内的多种RNA参与了组织细胞缺血、缺氧、炎症反应等一系列复杂的病理生理变化，而且在死后也能维持一段时间。这其中的一些RNA指标在不同的死因下呈现出了有意义的变化趋势，其表达量与PMI的特定关系可提高利用RNA来推断PMI的准确性和可靠性，并能为死因的分析提供一定的实验依据。

本研究通过实时荧光定量PCR技术对断颈死、窒息死、失血性休克死大鼠不同PMI心肌内各RNA指标相对表达量的研究发现：U6 snRNA表达量非常稳定，受PMI和死因的影响较小，适合作为内对照。在死亡早期，GAPDH、HIF-1、iNOS、TNF-α和IL-6的表达量在窒息组和失血性休克组比断颈组呈现不同程度的增加，且峰值出现的时间点不同，而β-actin在3个组皆呈现表达量下降趋势。在死亡晚期，随着mRNA的不断降解，表达量持续下降。各RNA表达量特征性的变化可为不同死因下PMI的推断提供参考。如何选择、优化各RNA指标并综合应用于不同死因下人体样本的PMI推断，是我们进一步研究的方向。

（本研究受复旦大学研究生创新基金项目资助。）

[1]Zhao D，Ishikawa T，Quan L，et al.Postmortem quantitative mRNA analyses of death investigation in forensic pathology：an overview and prospects[J].Leg Med（Tokyo），2009，11（S1）：43-45.

[2]李文灿，马开军，张萍，等.大鼠心肌组织中microRNA和18S rRNA的降解与死亡时间的相关性[J].法医学杂志，2010，26（6）：413-417.

[3]Maeda H，Zhu BL，Ishikawa T，et al.Forensic molecular pathology of violent deaths[J].Forensic Sci Int，2010，203（1-3）：83-92.

[4]张更谦，周斌，杜冰，等.鼠窒息后缺氧诱导因子1-α在心、肺中的表达[J].法医学杂志，2006，22（6）：407-410.

[5]张恒，李文灿，张萍，等.组织RNA检测用于死亡时间推断的研究进展[J].中国法医学杂志，2012，27（4）：292-295.

[6]Vandesompele J，De Preter K，Pattyn F，et al.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].Genome Biol，2002，3（7）：Research0034.

[7]张萍，马开军，张恒，等.实时RT-PCR常用内对照在死亡早期人心肌内的稳定性[J].法医学杂志，2012，28（2）：81-84.

[8]Burke JE，Sashital DG，Zuo X，et al.Structure of the yeast U2/U6 snRNA complex[J].RNA，2012，18（4）：673-683.

[9]Romanowski T，Markiewicz A，Bednarz N，et al.Housekeeping genes as a reference in quantitative real-time RT-PCR[J].Postepy Hig Med Dosw（Online），2007，61：500-510.

[10]Sirover MA.New insights into an old protein：the functionaldiversityofmammalianglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase[J].Biochim Biophys Acta，1999，1432（2）：159-184.

[11]Greijer AE，van der Groep P，Kemming D，et al.Up-regulation of gene expression by hypoxia is mediated predominantly by hypoxia-inducible factor 1（HIF-1）[J].J Pathol，2005，206（3）：291-304.

[12]Hierholzer C，Billiar TR.Molecular mechanisms in the early phase of hemorrhagic shock[J].Langenbecks Arch Surg，2001，386（4）：302-308.

[13]Iadecola C，Zhang F，Casey R，et al.Inducible nitric oxide synthase gene expression in vascular cells after transient focal cerebral ischemia[J].Stroke，1996，27（8）：1373-1380.

[14]余娴.缺氧通过HIF-1α诱导心肌细胞分泌TNF-α的机制研究[D].武汉：华中科技大学，2010.

[15]Yao YM，Redl H，Bahrami S，et al.The inflammatory basis of trauma/shock-associated multiple organ failure[J].Inflamm Res，1998，47（5）：201-210.