植物组培脱毒技术及其在药用植物藏红花中的应用

李军 高广春 李白 朱志明

（1. 嘉兴市农业科学研究院，嘉兴 314016；2. 嘉兴学院 医学院，嘉兴 314001；3. 嘉兴市天禾藏红花专业合作社，嘉兴 314000）

植物病毒广泛存在于果树、蔬菜、花卉等植物中，病毒通过植物的无性繁殖在植物体内传递及积累，最终造成植物生长受到抑制、产量及品质下降。病毒感染是无性繁殖植物种质退化、产量和品质下降的主要原因。自从1952年Morel［1]利用感染花叶病毒的大丽菊茎尖分生组织培养得到无病毒植株以来，植物组培脱毒技术便在生产实践中得到了广泛应用。植物组培脱毒技术是利用病毒在植物体内分布的不均匀性（在植物茎尖等分裂旺盛、生长迅速的组织细胞内含量很低）及植物细胞的全能性，采用不含病毒的植物组织或细胞进行组织培养，利用植物细胞的全能性最终分化获得无病毒植株。通过植物组培脱毒方法，可以脱除患病毒病植株的病毒，起到植株复壮，提高产量及质量的作用。植物组培脱毒技术现已在马铃薯、甘薯、草莓、部分观赏花卉及药用植物的组培快繁中得到广泛研究及应用，对其规模化、标准化及区域化生产应用起到推动作用。

藏红花（Crocus sativusL.）是鸢尾科番红花属多年生草本植物，主要靠分球无性繁殖。长期无性繁殖容易积累病毒，使品质及产量下降。藏红花主要病毒有芜菁花叶病毒（Turnip mosaicvirus，TuMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、鸢尾花叶病毒（Irismosaicvirus，IMV）、烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）和菜豆黄花叶病毒（ByMV）［2-4]，通过组织培养的方式培育无病毒球茎是提高藏红花种球质量和产量的有效途径。

本文综述了植物组织培养脱毒的技术方法及其近几年的应用情况，同时针对药用植物藏红花脱毒球茎培育中应用的脱毒技术做了总结及探讨。

1 植物组织培养常用脱毒技术

1.1 茎尖培养脱毒

茎尖培养脱毒是利用病毒在植物体内的分布不均匀性，在分裂旺盛的茎尖尤其是生长点区域（0.1-1.0 mm）带病毒最少或不带病毒，越靠近尖端，病毒含量越低。因为病毒在植物体内随维管系统迁移，在茎尖分生组织中没有维管束系统，病毒通过胞间连丝传递比较慢，而细胞分裂速度快，所以茎尖生长点部位几乎没有病毒［5]。茎尖脱毒和再生的关键是切取茎尖的大小，因为脱毒的成功率与茎尖大小成反比，而再生能力与茎尖大小成正比，因此切取合适大小的茎尖分生组织是茎尖培养脱毒成功的关键［6]。茎尖培养具有脱毒效果好、繁殖系数高、变异率低的优点，但也受到取材大小的限制。

自从1952年Morel［1]阐明用茎尖分生组织可从大丽菊中消除病毒以来，茎尖培养脱毒技术在植物组织培养脱毒中得到广泛研究与应用［7-12]，大量研究结果表明，0.2 mm左右的茎尖在脱毒率和成活率方面可以达到最优。以0.2 mm茎尖为外植体，马铃薯的成活率和脱毒率分别为68%和56%［13]，葡萄的成活率和脱毒率为75%和12%［14]。

1.2 热处理结合茎尖培养脱毒

由于茎尖培养受取材大小的限制，近年来在植物组织培养中多采用热处理结合茎尖培养的方法脱毒，这种方法对于一些难于用茎尖培养或热处理脱毒的果树病毒效果很好。采用这种方法，即使用大的外植体，也能增加获得的无病毒植株数。热处理脱毒主要是利用病毒受热的不稳定性而失去其活性达到脱病毒的目的。热处理过程减慢病毒在植株体内扩散速度的同时加快植物的生长，针对不同植物、不同品种和不同植物病毒对温度的敏感程度不同的特点，进行一定温度和时间范围的热处理，使植物的生长速度明显超过病毒在植物体内扩散的速度，从而使一部分正在快速生长的植物组织，如顶芽、嫩稍的尖端不含病毒，把不含病毒的部分切下来接种到适宜的培养基上，最终培养出无毒植株［15]。

热处理结合茎尖培养脱毒的热处理一般采用35-55℃的热水或高温蒸汽、高温空气处理，温度越高处理的时间越短，处理时间根据温度及外植体的不同从4 h-40 d不等，多采用热处理结束后切取茎尖培养获得无毒苗［16-19]。解晓红等［16]用半夏无菌苗为外植体，38℃高温40 d后切取茎尖培养，脱毒率达到88.9%。针对不同的材料选择合适的热处理温度及时间，如40℃水浴热处理草莓匍匐茎4 h［17]、36℃热处理百合珠芽10 d［18]、38.5℃热处理罗汉果组培苗10 d［19]，可获得脱毒率为100%的无毒苗，

由于外植体成活率随热处理时间增加而降低，近几年还发展出了变温处理结合茎尖培养来提高外植体成活率和脱毒率的方法。顾沛雯［20]研究了变温处理对葡萄组培苗的脱毒效果，发现变温（白天38℃，夜晚32℃）比恒温（38℃）处理成活率提高15.6%，成活率达到50%，而脱毒率相差不大。同时与单纯茎尖培养相比，热处理后小株成活率和脱毒率平均增加7.5%和8.5%。石贵玉等［21]研究了毛葡萄的组培脱毒技术，发现变温处理（白天 37℃处理8 h，晚上22℃处理16 h）10-15 d，茎尖存活率可达80%以上，脱毒率达100%。

1.3 愈伤组织诱导脱毒

愈伤组织诱导脱毒是通过植物器官或组织的培养来诱导产生愈伤组织，从愈伤组织分化出芽并长成植株，经病毒检测筛选获得无毒植株的方法。愈伤组织诱导脱毒的应用中常结合茎尖培养及花药培养等来提高脱毒效率。愈伤组织诱导脱毒技术现已在甘蔗、草莓和马铃薯等多种植物上获得成功。

李松等［22]研究了甘蔗茎尖胚状体脱毒苗快繁技术，研究发现茎尖胚状体分化苗增殖5代后扩繁2 589倍，宿根矮化病（Ratoon stunting disease，RSD）病毒去除率95%、花叶病去除率100%。晁慧娟等［23]及肖君泽等［24]以花粉发育处于单核靠边期的草莓花蕾为外植体进行花药脱毒培养，结果表明预冷处理72 h是最适合的花药低温处理时间，研究还筛选出最适合花药愈伤组织诱导及不定芽分化的培养基。

1.4 病毒抑制剂处理脱毒

病毒抑制剂能够不同程度地脱除植物病毒，其作用机理主要为竞争寄主细胞表面受体、阻碍病毒穿入脱壳、阻碍病毒生物合成和提高寄主抗病能力4种方式。采用病毒抑制剂与茎尖培养相结合的脱毒方法，对取材大小要求不严并且能脱除多种病毒，接种茎尖可大于1 mm，容易分化出苗，提高存活率［25]。对于有些比较难脱除的病毒，采用病毒抑制剂结合热处理和茎尖培养的方法使用，效果较好。

目前常用于组织培养的病毒抑制剂有9-（2-羟二氧）甲基鸟嘌呤、2-硫尿嘧啶、叠氮胸苷、DHT和病毒唑等。在众多病毒抑制剂中，病毒唑的抑制效果较好，也得到了广泛应用，研究发现35 mg/L病毒唑对不同品种的马铃薯病毒脱除效果都可以达到60%-80%，比没有添加病毒唑的茎尖处理脱毒效果提高27%［28]；40 mg/L和60 mg/L病毒唑对李痘病毒（Plum pox virus，PPV）的脱毒率达到15.38%和16.66%［29]。针对不同的材料需要研究合适的脱毒效果最好的病毒抑制剂，李正民等［26]研究了不同病毒抑制剂对蝴蝶兰建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV）和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）的脱除效果，研究表明安吉寡糖素的脱毒效果最好，对CyMV的脱除率为83.33%，对ORSV的脱除率为66.67%；顾沛雯［20]研究发现病毒钝化剂（WCT和丰源宝）处理对葡萄病毒具有良好的抑制作用。

在病毒抑制剂与其他脱毒方法结合使用方面，张惠华等［27]发现对东方百合进行热处理（39℃处理15 d）后结合10 mg/L病毒唑来处理，百合无症病毒（Lily symptomless virus，LSV）及百合斑驳病毒（Lily mottle virus，LMoV）脱毒率分别达到55%和40%。

1.5 超低温处理脱毒

超低温处理脱毒是近些年发展起来的一种新的脱毒方法，其原理是利用液氮超低温（-196℃）对植物细胞的选择性杀伤，得到存活的顶端分生组织。顶端分生组织能够在超低温处理后存活，与其自身的细胞特性有关。含有病毒的细胞的液泡较大，液泡中含有的水分多，在超低温处理过程中易被形成的冰晶破坏致死，而增殖速度较快的顶端分生组织含水分少，胞质浓，抗冻性强，不宜被冻死。液氮中的超低温能杀死含有较大液泡的细胞，而保存液泡小的顶端分生组织细胞，顶端分生组织不含或只含有少量病毒，因此得到的植株很有可能是无毒的。

超低温脱毒方法最早由Brison等［30]开创，他们用超低温结合茎尖培养脱毒方法，成功的去除了李属根状茎上的李痘病毒（Plum pox virus，PPV），脱毒率达到50%，是茎尖剥离脱毒率19%的2.5倍。Wang等［32，33]应用该技术做了大量研究，将该技术应用于马铃薯、甘薯、葡萄等植物，并获得了无毒植株，同时还将超低温处理、热处理及茎尖培养技术结合起来脱除了木莓丛矮病毒（Raspberry bushy dwarf virus，RBDV）脱毒率达到35%。Helliot等［31]利用超低温脱毒方法，从香蕉中脱除黄瓜花叶病毒及香蕉条斑病毒（Banana streak virus，BSV），病毒脱毒率达到30%和90%。靳慧洁等［34]结合超低温脱毒、茎尖培养及热处理脱毒方法成功获得了百合脱毒苗。超低温处理脱毒基于超低温保存，理论上，只要能利用超低温保存种质的植物都可以用超低温处理进行脱毒，其应用前景非常广阔［35，36]。

2 藏红花脱毒种球培育方法

由于藏红花叶基生，没有一般意义的茎，其生长点位于叶丛基部与球茎结合处，剥取其茎尖难度极大，同时0.5 mm以下微茎尖成活率低，剥取难度大，而较大茎尖一般脱毒效果不佳［2]，现有藏红花脱毒球茎培育研究多采用茎尖培养结合热处理、愈伤组织诱导及病毒抑制剂等方法才能获得较高的成活率及脱毒率。

朱保华等［2]采用变温处理结合茎尖培养与化学处理结合茎尖培养2种方法培育出了不含CMV、TuMV、TRV及IMV病毒的藏红花植株。将带芽点的球茎进行变温处理36℃（12 h）/18℃（12 h）后，剥取0.5-1.0 mm的茎尖进行培养，茎尖成活率26.7%；将3-5 cm带叶片的球茎灭菌后取0.5-1.0 mm的茎尖接种到添加5-10 mg/L浓度病毒唑的分化培养基上培养，茎尖成活率25%-45%。陈书安等［3]用热处理结合愈伤组织诱导方法获得了无毒芽，以高温处理（35℃）的分化芽为外植体，经诱导25 d后获得愈伤组织，该愈伤组织再经过高温处理（35℃）可获得高温脱毒的藏红花愈伤组织，再分化培养50 d后可获得高温脱毒的藏红花分化芽。朱昱等［37]采用茎尖培养结合愈伤组织诱导方法也获得了脱毒球茎。

3 结语

通过组织培养脱毒可以提高作物产量及质量，组培脱毒技术也得到越来越多的研究与应用，目前通过组培实现商业化的脱毒试管苗在果树、蔬菜、花卉及药用植物上的研究已经十分普遍，如马铃薯、甘薯、苹果、葡萄、草莓、蝴蝶兰、天山雪莲和金线莲等。植物组培脱毒技术的不断改进和提高以适应大规模的工厂化和商品化势在必行。脱毒技术的应用也逐步从茎尖培养、热处理脱毒、病毒抑制剂处理等单一脱毒方法向2种、3种方法结合使用发展，逐步提高脱毒率及成苗率。

目前藏红花组织培养方面的研究多集中在通过球茎切块来分化成芽或通过球茎切块诱导愈伤组织并进一步分化成芽的快繁研究［38-41]，对于脱毒球茎的研究报道很少。球茎切块直接诱导分化成芽不能达到脱毒的目的，通过诱导愈伤组织分化成芽虽然增殖系数比球茎直接诱导成芽高，而且有可能获得无毒植株，但是脱毒率低。由于藏红花难于直接剥取0.5 mm以下茎尖来进行茎尖培养，同时球茎取材相对容易、组培快繁方面（球茎切块诱导愈伤组织及直接分化成芽）的研究较多，为藏红花培育脱毒球茎提供了新的研究思路，因此通过球茎切块诱导愈伤组织结合热处理或病毒抑制剂处理将是藏红花无毒球茎培育的有效途径。

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