鸭瘟病毒的免疫学研究进展

赵军 杨孝朴 宋晓育

（甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070）

鸭瘟（Duck plague，DP）又称鸭病毒性肠炎，是由鸭瘟病毒（Duck plague virus，DPV）引起的鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血型疾病［1]。DP主要临床特征为体温显著升高，两腿酸软无力，下痢，两眼流泪和部分病鸭头、颈部肿大。DP最早于1923年出现在荷兰，随后在印度、比利时、意大利、英国、法国等相继出现，1967年在美国东海岸流行，中国于1957年首次报道。多年来鸭瘟以高达20%-90%的死亡率引起社会广泛关注。DP的传播速度很快，加上集约化养鸭业鸭群密度高、流动频繁、极易引起流行。该病在一个大流行期后常呈地方性流行，长期危害养鸭业，造成巨大的经济损失。由于其病原学特性，使目前的多种疫苗的保护作用不太理想，笔者概述了近年来有关DPV的免疫学研究进展，为寻找更有效的新型疫苗提供新的思路。

1 DPV的主要抗原蛋白

DPV属于疱疹病毒科，疱疹病毒亚科，鸭疱疹病毒1型，为长约150-170 kb的线状双股DNA病毒［2]。DPV的编码蛋白有囊膜蛋白，统一命名为gL（UL1）、gM（ULl0）、gN（UL49. 5）、gH（UL22）、gB（UL27）、gC（UL44）、gL（（UL53）、gG（gX/US4）、gJ（USl）、gD（US6）、gI（US7）和gE（US8）。这12种糖蛋白，除gG外，其他糖蛋白为病毒囊膜的组成成分。gB蛋白是DPV的优势结构蛋白并为其主要免疫原性蛋白。衣壳蛋白由UL6、UL18、UL19、UL26、UL26.5、UL35和UL38基因产物组成，其中UL19为主要的衣壳蛋白，UL6为次要衣壳蛋白。皮层蛋白由UL7、UL11、UL14、UL16、UL36、UL37、UL46、UL47、UL48、UL49和UL51基因编码产物组成，其中UL36为主要的抗原蛋白［3]。DPV全毒免疫实验动物得到的单克隆抗体是针对NP蛋白的，但NP蛋白不能诱导机体产生中和抗体［4]。由于DPV各个毒株之间差异不大，所以DPV各亚群之间gB具有较多的同源性。gB蛋白有DPV主要的抗原位点，是淋巴细胞增生性应答的靶点，同时参与细胞免疫和体液免疫，特别是诱导综合抗体的产生，由此可以认为gB蛋白是发展新型疫苗的良好靶抗原［5]。最新的研究发现结构蛋白如gC蛋白，一些非结构性蛋白在DPV感染过程中也能产生一定的免疫活性［6]。

2 DPV持续性感染

持续性感染是DPV严重危害的一个明显特征。持续性感染即DPV在鸭或水禽体内持续存在，没有任何的临床症状表现，带毒时间从几个月到几年不等，导致长期的病毒血症。该病毒侵入鸭体，可潜伏于三叉神经节造成感染，使病鸭终身带毒并周期性向体外排毒在鸭群中广泛传播［7]。DPV持续性感染有以下原因造成的：第一，就宿主而言，DPV在相关免疫细胞如单核细胞中增殖，最终使宿主大量的免疫细胞受到损伤，进而导致鸭的免疫抑制；另一方面，鉴于DPV囊膜蛋白和衣壳蛋白是主要的保护性抗原，且UL6基因在病毒增殖方面的巨大作用及在不同毒株中的高度保守性［8]。由此推断，病毒粒子表面具有诱导中和抗体功能的囊膜糖蛋白抗原当其表位发生突变时，就能逃避免疫系统的识别和清除，造成长期的病毒血症和持续性感染。

3 黏膜免疫

正常情况下，黏膜是保护机体免受病原侵害的主要屏障，而黏膜在病理情况下，不具备免疫反应能力，病原体就会侵入机体。黏膜免疫系统（MIS）被发现以来，已成为科学家的研究热点，并取得很大成就。MIS是机体免疫系统重要的组成成分，也是免疫系统阻止病原入侵的第一道防线。有研究证实，机体95%以上的感染发生在黏膜表面［9-12]，而已知黏膜部位的免疫细胞和免疫分子数量均超过了具体的系统免疫，让MIS成为机体最大的免疫器官［13-15]。有研究表明，DPV感染20日龄鸭后3 d，即可在消化道和呼吸道分泌液中检出DPV特异性SI-gA，60 d后仍能检出此抗体。以此表明SIgA是在消化道和呼吸道黏膜中抗DPV的主要特异性体液免疫因子，是MIS参与机体免疫应答的主要特征［16-18]。另有研究证明在黏膜某个位置的刺激，能使局部和黏膜表面远端都产生特异性SIgA，这种SIgA产生的内在联系，即为共同黏膜免疫系统（CMIS）［19，20]。同时有试验结果证实：口服DPV后，鸭直肠分泌液中DPV特异性SIgA产生时间早于空肠、回肠，说明CMIS也存在划分，产生IgA的B细胞可由黏膜诱导位点有选择性向某些效应位点移动，而并非向所有黏膜表面移动［21]；呼吸道SIgA抗体滴度与十二指肠和食道同期相比，结果偏低，主要原因是MIS呈现局部免疫特点，即一个黏膜部位致敏的免疫细胞，由胸导管进入血液循环并且分化成熟，在特异归性巢受体的介导下，大多数（80%）免疫细胞归巢致敏部位黏膜固有层上皮内，发挥免疫效应，而剩下的（20%）归巢其他地方，发生免疫效应［19，20]。以上研究提示，DPV诱导鸭局部MIS时，GALT比BALT和NALT更好的产生黏膜免疫应答［21]。

3.1 细胞免疫

研究表明，T细胞介导细胞免疫应答在DPV感染过程中有重要作用。细胞免疫应答由胸腺依赖性抗原（TD）引起，有抗原递呈细胞，包括巨噬细胞，树突状细胞，受感染的组织靶细胞，有免疫作用的辅助性T细胞（Th、CD4+，有炎症反应的效应T细胞（TD、TDHT、CD4+）和对靶细胞产生特异性杀伤作用的细胞毒性T细胞（TC、CD8+）。研究发现，在DPV感染早期，感染鸭的中枢免疫器官发生明显变化，在DPV感染后2 h，即可在脾脏等重要的中枢免疫器官中检出DPV的DNA，表明鸭感染DPV后，主要对中枢免疫器官造成攻击和损伤，使DPV对鸭的感染力增强，为实现DPV的全身组织感染和广泛的嗜性提供条件。在分子水平上，一定程度解释了鸭感染DPV后出现的全身败血症和大面积的组织器官损伤［22]。在有丝分裂原ConA的刺激下，T淋巴细胞转化为淋巴母细胞的效率是考察机体细胞免疫功能状态的重要指标之一，而CD3+是鉴定T细胞的主要标记，反映了T淋巴细胞的总量，若T淋巴细胞总量降低，使细胞免疫反应的启动、诱导和效应都有所降低。程志萍等［23]在淋巴细胞游走抑制试验中证明细胞免疫对DPV的免疫保护作用。表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，是T细胞抗原受体和B细胞抗原受体及抗体特异性结合的基本单位［24]。研究表明，gB蛋白和gC蛋白都能刺激T淋巴细胞的增生，但是gB蛋白作用弱，而gC蛋白作用强。各种蛋白的诱导作用与跨膜糖蛋白有密切的关系，表明gC蛋白在细胞免疫中居主要地位［6，25]。

3.2 体液免疫

DPV感染机体后可导致机体产生全身性的体液免疫应答。产生的特异性抗体主要针对DPV的结构蛋白——gB蛋白。体液免疫由依赖性抗原递呈细胞和Th细胞参与的非胸腺依赖性抗原（Tl）的诱发［26]。鸭感染DPV后5 h左右就可以检测到特异性抗体IgM，抗体效价在28 d达到峰值，并维持182 d的高水平效价状态。临床和实验室证实DPV感染后可迅速在血液中检测到高滴度的特异性抗体IgG［27，28]。因为IgM和IgG抗体是体液免疫的主要抗体，IgM在DPV感染早期发挥重要的抗感染作用；IgG是滴度水平最高的抗体，在抗感染中发挥中坚作用。所以，在疫苗接种后，能否在最短时间内产生IgM，在对疾病紧急免疫中非常重要，而能否长时间高滴度的产生IgG抗体，是评价疫苗好坏的标准。有试验证实，DPV特异性抗体IgM和IgG发展规律呈现典型的双峰现象，是弱毒疫苗诱导机体产生抵抗DPV的主要抗体，是该病毒突破黏膜免疫后重要的防线［17]。

4 免疫抑制

免疫抑制是因为免疫系统受到损害导致机体暂时或永久的免疫应答功能不全和对疾病的高度敏感。有资料证实DPV是鸭的一种免疫抑制性传染病［29]。DPV人工感染2月龄SPF鸭胚后，试验鸭中枢免疫器官胸腺、法氏囊表现为淋巴细胞减少，组织间隙增大；感染后48-96 h，中枢免疫器官的淋巴细胞极度减少，网状细胞增生，组织器官结构模糊不清，严重出血、充血［30]。由此造成感染鸭的免疫力低下，从而引发免疫抑制，造成多系统、多器官疾病，如各种继发性细菌感染性疾病、败血症、病毒血症等。

5 病毒与宿主的相互免疫

机体的免疫编辑学说［31]认为，在病原入侵和机体免疫的整个发展过程中，免疫系统和抗原之间发生相互免疫作用，免疫系统杀伤抗原的同时，选择出新的抗体，与原发抗体不同，这种新的抗体表现出较高的特异性，同样免疫系统受抗原的编辑后影响其对抗原的杀伤能力。因此，研究免疫系统和抗原之间发生相互编辑的分子基础，对如何提高免疫系统的抗病毒效应有重要的意义。

6 展望

DP是现在影响养鸭业的重大传染病，就目前DP的防治情况看，国内外仍没有确实有效的药物可以治疗，所以，免疫预防仍然是防控DP的主要手段。目前，DPV的弱毒疫苗和灭活疫苗已经上市，但是灭活疫苗的免疫效果不理想，而弱毒疫苗虽然取得较理想的免疫效果，但存在毒力返强和扩毒、散毒问题，给DP防控留下了隐患。所以，开发新的疫苗成为有效防控DP的必经之路，深入研究DPV的特性和免疫机制，对能否开发出高水平的新型疫苗起着至关重要的作用。综上所述，开发一种新型的DP疫苗，应该充分利用DPV的致病基因、免疫原性基因和特有的结构蛋白、非结构蛋白等，使用病毒载体（病毒进入细胞后，首先要完成的是其自身基因的转录复制，再进行其基因的表达；然后是核酸分子与结构蛋白的组装，最终形成新的病毒子代。在病毒自身蛋白合成的过程中，插入病毒的某一特定的外源基因要同时被转录、表达，形成相应的蛋白分子）在最短的时间内，不仅激发机体的体液免疫应答，还要激发较强的细胞免疫应答，才可能提供较为全面的免疫保护。相信在不久的未来，如果以如何激发鸭机体细胞免疫为主要研究方向，可能会研究出更有效的新型DP疫苗。

［1] Berger PH, Adams MJ, Barnett OW. Virus taxonomy：eight report of the international committee on taxonomy of viruses［M] . London：Elsevier Academic Press, 2004：819-841.

［2] 陈建君, 张毓金, 杨增岐, 等.鸭瘟病毒的分子生物学研究进展展［J] .动物医学进, 2003, 24（6）：25-28 .

［3] 马波.鸭肠炎病毒ul27基因特征及其编码蛋白部分抗原表位优势区的鉴定［D] . 哈尔滨：东北农业大学, 2008：12-13.

［4] 代淑燕, 寨鸿瑞, 文明扣, 等.鸭肠炎病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达［J] .生物技术, 2008, 18（4）：12-15.

［5] Plagemann PG. Complexity of the single linear neutralization epitope of the mouse arterivirus lactate dehydrogenaseelevating virus［J] .Virology, 2001, 290（1）：11-20 .

［6] 崔立虹, 宋鸽, 王晓东, 等.鸭肠炎病毒gC糖蛋白胞外区优势抗原表位的筛选与鉴定［J] . 畜牧兽医学报, 2011, 42（8）：1126-1133.

［7] 朱树全, 邬孝江.鸭疱疹病毒I型套式PCR检测方法的建立及应用［J] . 中国畜牧兽医, 2013, 40（8）：210-211.

［8] 孙涛. 鸭瘟病毒UL-6基因主要抗原域的原核表达和应用［D] .雅安：四川农业大学, 2008.

［9] 朱敏艳, 袁喜英, 宗莉. 基因疫苗微粒系统黏膜免疫的研究进展［J] . 药物生物技术, 2008, 15（3）：223-226.

［10] 李春松, 戴晋军, 李彪. 家禽的黏膜免疫研究及功能［J] . 国外畜牧学, 2012, 7（2）：75-77.

［11] 姜厚涛, 吴国华, 张强. 动物黏膜免疫的研究进展［J] . 中国兽医科学, 2013, 16（34）：655-660.

［12] 张蕊, 高雪丽, 郑世民. 家禽黏膜免疫系统与疫苗免疫［J] .中国家禽, 2012, 170：46-48.

［13] Pabst R. IsBlat amajor component of the human lung immune system?［J] . Immunol Today, 1992, 13： 119-122.

［14] Kolopp-Sarda MN, Bene MC, Massin N, ct al. Immunohistological analysis of macrophages, B-cells and Tcells in the mouse lung［J] . Anat Ree, 1994, 239：150-157.

［15] Brandzae G. Molecular and cellular aspects of the secretory immunoglobulin system［J] . APMIS, 1996, 103：1-9.

［16] 肇慧君, 陈伟业, 葛金英.鸡SIgA重链单克隆抗体的制备及新城疫病毒和禽流感病毒特异黏膜SIgA检测方法的建立［J] .中国预防兽医学报, 2012, 34：138-142.

［17] 齐雪峰, 杨晓燕. 鸭瘟弱毒疫苗诱导 IgA、IgM 和 IgG 产生规律的研究［J] . 中国农业科学, 2008, 41（10）：3305-3310.

［18] Langford TD, Housley MP, Boes M. Central importance of immunoglobulin A in host defense against Giardia spp［J] .Infection and Immunity, 2002, 4：11-18.

［19] 马金萍, 杨树宝. 禽类共同黏膜免疫系统的研究进展［J] . 中国家禽, 2013, 35（9）：47-49.

［20] Liliehoj HS, Trout JM. Avian gut—associated lymphoid tissues and intestinal imnlune responses toEimeria parasites［J] . Clinical and Microbiology Reviews, 1996, 7：349-360.

［21] 齐雪峰.鸭瘟强、弱毒株在感染鸭体内的动态分布及免疫应答［D] . 雅安：四川农业大学, 2008.

［22] 程安春, 汪铭书, 刘菲, 等.PCR在鸭瘟临床诊断和免疫及致病机理研究中的初步应用［J] . 病毒学报, 2004, 20（4）：364-370.

［23] 程志萍, 程安春, 汪铭书, 等.鸭瘟弱毒疫苗诱导免疫鸭细胞和体液作用的研究［C] //中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第四届第九次学术研讨会论文集（下册）, 河南：2008 .

［24] 孙立英. 抗原特异性调节性T细胞的扩增方法及应用前景［J] .现代免疫学, 2010, 3（30）：248-252 .

［25] 潘华奇, 曹瑞兵, 王楠, 等.鸭瘟病毒gB蛋白N端抗原域的高效表达及其免疫特性［J] .农业生物技术学报, 2008, 16（5）：743-747 .

［26] Fraile L, Calsamiglia M, Mateu E, et al . Prevalence of infection with porcine circovirus-2 and porcine reproductive and respiratory syndrome virus in an integrated swine production system experiencing postweaning multisystemic wasting syndrome［J] .Can J Vet Res, 2009, 73（4）：308-312 .

［27] 张佩, 吴恩应, 陈玉琴. 特异性抗体效价检测技术概述［J] .现代生物医学进展, 2011, 17：3377-3381.

［28] IslamMA, Samad MA, Rahman MB, et al. Assessment of immunologic responses in khaki cambell ducks vaccinated against duck plague［J] . International Journal of Poultry Science, 2005,4（1）：36-38.

［29] 黄瑜, 祁保民, 彭春香,等. 鸭的免疫抑制病［J] . 中国兽医杂志, 2010, 7：50-52

［30] 张坤, 刁有祥, 程彦丽, 等. 鸭瘟病毒强毒株感染SPF鸭动态病理组织学变化［J] . 中国兽医学报, 2013, 33（1）：9-10.

［31] Dun GP, Koebel CM, Schreiber RD. Interferons, immunity and cancer immunoediting［J] . Nat Rev Immunol, 2006, 6（11）：836-848.