电生理技术在鱼类尾部神经分泌系统研究中的应用

吕为群 程若冰 兰兆辉

(上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海 201306)

电生理技术在鱼类尾部神经分泌系统研究中的应用

吕为群 程若冰 兰兆辉

(上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海 201306)

200多年前, Galvani通过神经-肌肉兴奋性实验发现了神经系统与电活动在功能上具有本质的联系[1,2]。此后,众多研究者投入了大量的精力研发电生理设备, 逐步开发出多种能够精确测量和控制神经元电活动的仪器, 如:放大器、示波器、刺激器、数模/模数转换器、微电极等。现代电生理设备和技术的更新换代为研究单离子通道电流甚至更为复杂的神经元网络电特性创造了条件[3]。随着近代电子技术水平和分子生物学的飞速发展, 电生理技术已成为研究鱼类生理功能、行为特征、环境适应性的一种有效的技术和方法。尾部神经分泌系统(CNSS)是鱼类特有的神经分泌系统, 在维持鱼类体内渗透压的平衡、内环境稳定及生殖调控等方面发挥着至关重要的作用[4]。本文主要围绕电生理技术的发展和原理及其在研究 CNSS功能和 Dahlgren细胞电生理特性等方面的应用, 综述了国内外的研究成果和进展。

1 电生理技术

电生理技术用于记录生物细胞和组织的电学特性,可测量从单离子通道蛋白到整个器官的多种规格样本的电压或电流变化, 研究不同神经组织的自发和诱发电活动与代谢的关系。该技术最初主要用于神经系统的研究,即用电流刺激神经系统某一部位, 记录该部位或单个神经元的电位变化。电生理学研究方法在神经生物学研究应用中优点颇多: 对被测样本损害小; 测量精度高; 重复性强; 实验方式多样化, 可针对不同的研究需要采取不同记录方式; 可以对神经系统功能活动进行定量分析; 便于和其他研究方法配合使用等[3,5,6]。电生理技术发展至今, 演化出了适合各种不同研究的记录方式, 如: 胞外记录(单细胞记录、多细胞记录)、胞内记录(电压钳、电流钳)、膜片钳记录等。

1.1 电生理技术的发展

人类对于生物电现象的记录可以追溯到 2000多年前。据记载, 古埃及尼罗河中有一种鲶鱼(Phractocephalus hemioliopterus)可产生高达350V的电压脉冲[7]。罗马帝王Claudius时代(公元41—54年)的Scribonius Largus曾详细描述人们利用电鳐治疗头痛病[8]。1791年, Galvani首次报道用金属弓触碰蛙腿肌肉或刺激神经时看到了肌肉的收缩, 提出了动物电的概念, 奠定了现代电生理学的基础[1,2]。1849年Du Bois-Reymond发现了生物电的两种基本形式: 静息电位和动作电位, 使电生理学开始成为一门独立的学科[5]。20世纪中叶, Hodgkin, et al.成功证明了电兴奋现象和动作电位的产生是缘于特定的离子电导变化, 基于此, Cole, et al.发明了电压钳技术, 后经Hodgkin, et al.改进[9,10]。1976年Neher和Sakmann创建的膜片钳技术为电生理学和细胞生物学的发展乃至整个生物学研究带来了一场革命, 人类对离子通道本质的认识也因此有了一个质的飞跃[5—7]。

1.2 常用电生理技术

细胞外记录 细胞外记录是电生理技术常用的记录方式之一, 其方便之处在于记录电极不需要插入细胞,可用一根电极记录单细胞或同时记录多个细胞的电活动。由于活动部位的神经元产生去极化, 不活动部位的处于正常极化状态, 在容积导体中的两部位间电位不同, 电流从一点流向另一点, 两点间的电位差就会被记录电极探测到。胞外记录受样本限制少, 记录到的电活动稳定性好, 可用于长时间电位诱导和记录, 并能同时从不同的神经结构进行多导电位记录。通过不断地改进与发展, 该方法由仅限于固定、半固定动物上的应用, 逐渐发展应用于自由活动的动物[5,7,11]。

细胞内记录 1939年, Hodgkin, et al.将毛细玻璃微电极从枪乌贼巨轴突切口纵向插入巨轴突内, 首次实现了静息电位和动作电位的细胞内记录[12]。记录膜电位需要在膜的两侧各放置一个电极形成一个环路, 因此记录电极要插入细胞膜内, 这种记录方法即为电生理细胞内记录。细胞内记录可以准确测量静息膜电位的绝对值,还能测定兴奋性突触后电位、抑制性突触后电位及动作电位。细胞内记录技术的发明, 使得研究个别单一的神经细胞的活动机理、神经元膜的生理物理特性以及个别神经元在神经回路中的位置和作用成为可能[5,13]。

膜片钳技术 膜片钳技术属于现代微电极技术,是传统微电极技术的重大进步。通常采用尖端经过加热抛光的玻璃微电极吸管与细胞膜发生紧密接触, 在吸管内施加负压, 使微电极尖端与细胞膜表面形成 GΩ级(10—100 GΩ)的高阻封接(Giga-seal)从而记录穿过细胞膜的微弱的电流变化。膜片钳技术共有四种基本记录模式: 细胞贴附式(Cell-attached recording)、内面向外记录模式(Inside-out recording)、外面向外记录模式(Outside-out recording)以及全细胞记录模式(Whole-cell recording)[14—16]。该技术可用来记录反应细胞膜上离子通道分子活动的离子电流, 并能与其他生物学方法结合进行多领域研究。随着膜片钳技术的不断发展, 研究对象也逐渐扩展到离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制等方面[6]。

2 CNSS及Dahlgren细胞

2.1 CNSS的形态结构

1914年美国学者Dahlgren首次报道在鱼类脊髓末端发现有一种不同寻常的具有腺细胞形态特征的巨大细胞,这些巨大细胞后来被命名为 Dahlgren细胞。作为鱼类所特有的神经分泌系统, CNSS在维持鱼体内的渗透压平衡及生殖调控等方便发挥着至关重要的作用。CNSS由位于尾部脊髓中具有神经内分泌功能的 Dahlgren细胞、Dahlgren细胞向尾端发出的轴突以及富含轴突末梢和毛细血管网的尾垂体三部分组成[4,17—19]。Dahlgren细胞为大型神经分泌细胞, 分泌物通过轴突运送到尾垂体, 再由尾垂体直接分泌进入尾静脉, 这样可以使这些分泌物迅速抵达靶器官—肾、肠、性腺和肝脏[4], 这恰好便于研究者随时间推移测定分泌差异[20]。此外, CNSS作为研究神经分泌机制的良好系统模型, 优势在于体内和体外都能对其进行研究, 麻醉鱼体的CNSS可完全裸露出来, 便于标记[21, 22]。

2.2 Dahlgren细胞形态、位置、大小

Dahgren细胞是存在于鱼类CNSS中的大型神经分泌细胞, 通常位于脊髓末端的 1—8节, 其主要分泌物有尾加压素I(UI)、尾加压素II(UII)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)等, 这些神经肽能够调节体内渗透压和离子平衡[4,17]。Onstott和 Elde发现UI肽和UII肽集中在轴突膨大部位—尾垂体, 这里是存储分泌物的部位, 随后这些分泌物进入循环[23]。Dahlgren细胞是一种多突起的细胞, 其形态和大小通常是变化的, 而且在不同种类的鱼中各不相同。细胞体的形状有很多种, 如圆形、椭圆形、梭型或不规则型。细胞核通常很大, 核中有明显的核仁。在充满分泌物的细胞中,大多数只有一个核, 但在缺乏分泌物的细胞中则可观察到双核、三核等多核现象[24]。

3 电生理技术在CNSS研究中的应用

鱼类尾部神经分泌系统中的 Dahlgren细胞能够自发产生特征性的动作电位, 从而影响神经肽的分泌, 随着鱼体内渗透压的变化, Dahlgren细胞的动作电位发放模式也会随之作出相应的改变[25]。Brierley对Dahlgren细胞几种放电模式进行了定义: 暴发型(Burst): 由大于20s的不连续暴发型动作电位构成, 每次暴发之间有大于20s静息态间隔; 位相型(Phasic): 表现出不规则的动作电位发放,包括周期性的高频(1—3 Hz)和低频放电(＜1 Hz); 紧张型(Tonic): 由连续的动作电位(约1 Hz)构成, 中间只有很少或几乎没有间隔[26]。根据电生理特性的不同, Dahlgren细胞可分为T1型和T2型两种, T1型细胞表现较为活跃, 常会产生特征性的暴发放电, 而T2型Dahlgren细胞则相对安静且兴奋性较低, 在输入去极化电流后只能诱发单个的动作电位, 这说明T2细胞对于峰频具有很强的适应能力[27]。

3.1 Dahlgren细胞burst发放的研究

能够产生长时间高频率的暴发(Burst)型放电是脊椎动物和无脊椎动物神经分泌细胞的的共同特征, 如哺乳动物下丘脑神经元[28]、胰腺 β细胞[29]、巴西利亚海兔(Aplysia brasiliana)R15神经元[30]。暴发放电会提高神经肽的分泌率, 随着放电频率的增高, 轴突末端神经肽的分泌量也随之增加[31]。Brierley, et al. 用高敏微电极和玻璃吸电极分别对单个Dahlgren细胞和Dahlgren细胞群进行研究, 从而对 Dahlgren细胞产生的电活动模式及细胞膜固有的性质有了很好的了解。离体和在体情况下许多Dahlgren细胞都表现活跃, 且这两种情况下 Dahlgren细胞的动作电位发放模式也非常相似。Dahlgren细胞暴发放电的产生机制与已报道的哺乳动物神经元细胞类似, 如垂体后叶荷尔蒙神经元[32,33]。在欧洲川鲽Dahlgren细胞中, 暴发放电的产生基于膜本身的性质, 一次长时间的暴发放电能够由短暂的(小于 5s)去极化或超级化电流刺激所激发, 而随后的后去极化电位(ADP)刺激能够维持长达200s的暴发放电。ADP的产生与一种凹电位(sag电位)相关, sag电位是在膜电位为–50mv的情况下, 注入500ms的超级化电流导致的下凹型超级化应答, 由某些离子通道产生的内向电流激活。而ADP和sag都是电压依赖性的, 只有膜电位大于–60mv的情况下才能出现, 并且当膜电位接近–50mv时, 能够激发动作电位, 所以暴发放电只能产生于去极化状态的细胞[34]。

药理学研究表明ADP的产生依赖于L型Ca2+通道[17]。当缺乏外部钙离子或者存在 L型 Ca2+通道阻断剂nifedipine(硝苯吡啶)时, ADP的持续时间会明显减少。BayK 8644(能够增加L型离子通道开放时间)会显著增加ADP持续时间, 但 Ca2+激活非选择性阳离子通道阻断剂flufenamic acid(氟灭酸)对ADP的持续时间没有效果。用apamin(蜜蜂神经毒素)和 charybdotoxin(卡律布德蝎毒素)对Ca2+激活K+通道抑制, 会增加ADP和暴发放电的持续时间。然而, 动作电位的波形却不会受到 apamin/charybdotoxin, nifedipine,BayK 8644以及移除外部Ca2+的影响。在一次暴发放电过程中, 动作电位的发放由短持续时间(小于100ms)的去极化后电位(DAP)维持, DAP同样具有电压和L型Ca2+通道依赖性。这些动作电位的发放是电压依赖性的, 当细胞膜逐渐去极化, 细胞从静息态(约–70mv)转为暴发型和位相型, 最后转为紧张型(小于–65mv)。持续10s的暴发放电之后伴随着一个缓慢的 ADP(振幅为 10mv,持续 10—200s), 并且能够激发一个持续时间更长的暴发放电[34]。

3.2 环境盐度变化对Dahlgren细胞放电的影响

盐度是影响海水鱼类生长的重要环境因素之一, 而渗透压调节是鱼类盐度适应性的关键功能。应用膜片钳技术研究发现, 参与鱼类渗透压调节的主要是直肠腺、鳃和肾等器官上的各种离子通道, 这些通道参与了鱼体内NaCl 的动态平衡和水分代谢的调节作用[14]。川鲽Dahlgren细胞的特征性的动作电位发放会伴随着鱼体内渗透压的变化而改变。与适应淡水(FWA)的川鲽相比, 适应海水(SWA)的川鲽离体CNSS标本中Dahlgren细胞暴发放电更为活跃。同样的, CNSS在体实验显示, SWA川鲽中有更高比例的 Dahlgren细胞产生暴发型动作电位, 说明CNSS同样在鱼类渗透压调节适应中起到关键作用[21,26]。在SWA和FWA标本中, T1 Dahlgren细胞的后超级化电位(AHP)持续时间约为 T2细胞的 5倍, 而 SWA标本中T1、T2型 Dahlgren细胞动作电位的持续时间明显大于FWA标本。SWA 标本中T1型细胞在超级化电流刺激下会产生sag电位, 而FWA标本sag电位的产生具有电压依赖性, 只有当膜电位大于–50mv时, 超级化电流才能激发明显的sag电位。T1、T2型Dahlgren细胞在SWA和FWA标本中的膜参数(静息膜电位、输入阻抗)和动作电位参数(阈值、振幅、持续时间等)均无明显区别。Dahlgren细胞的放电模式会随着外部盐度环境的变化, 在不同放电模式间转换[26]。

3.3 神经内分泌物质对Dahlgren细胞放电调控的研究

CNSS会受到来自后脑的下行输入调控[35], 免疫组化和生物化学研究表明有肾上腺素、血清素、泌乳刺激素以及胆碱能和肽能等神经内分泌物质输入到CNSS中[36—38]。电生理研究发现, 这些神经调质能够促进或抑制Dahlgren细胞的放电, 并会改变动作电位发放的类型[26,39]。Dahlgren细胞放电类型的不同或者暴发放电的持续时间长短和强度大小都会在很大程度上影响神经肽的分泌。例如, 临产和泌乳时, 下丘脑催产素神经元同时产生高频率暴发动作电位会脉冲式地释放神经肽, 高频率暴发放电能提高神经末梢肽的分泌效率, 如细胞群同时产生暴发放电会分泌高浓度的神经肽。与催产素神经元的染色耦合不同,尽管目前还没有证据表明 Dahlgren细胞之间存在直接连接或突触连接, 但这些 Dahlgren细胞动作电位的协同发放可能会随着鱼类渗透压水平改变[40]。

一氧化氮(NO) 在神经系统中, NO作为一种重要的信使分子参与了学习与记忆等重要的神经生理活动,同时对脑部血流具有调节作用, 并参与神经系统的免疫防御[41]。已有报道表明 NO在哺乳动物下丘脑大型神经分泌细胞中起到神经调控的作用。在鱼类多个神经系统中检测到NOS(一氧化氮合酶)的存在, 如脑电机系统[42]、视网膜[43]、视前区-下丘脑-垂体系统[44]以及CNSS[45]。在离体CNSS标本药理学实验中发现, NO供体(SNAP, SNP)会增加Dahlgren细胞动作电位发放频率(包括之前处于静息态的细胞), 大部分Dahlgren细胞表现出位相型(phasic)动作电位。NOS(一氧化氮合酶)底物L-arginine(左旋精氨酸)会导致放电频率的增加, 激活静息态 Dahlgren细胞放电并增强暴发放电。这些不会受到NOS抑制剂L-NAME(L-硝基精氨酸甲酯)的阻断, 放电频率反而会随着 L-NAME的作用而提高。可见NO在CNSS中起到调控作用, 能够有效提高Dahlgren细胞电活动及神经肽的分泌[40]。

皮质醇 皮质醇作为广盐性鱼类适应盐度环境的一种重要激素, 能够激发鱼鳃氯化物分泌细胞的增殖,从而促进氯离子排放, 使鱼能够适应海水环境; 皮质醇同样可以通过调节氯化物分泌细胞的功能使鱼类适应淡水环境[46]。Marley, et al.对皮质醇调节Dahlgren细胞放电作用的研究显示, 在对离体 CNSS标本进行皮质醇灌流(15min)期间, Dahlgren细胞的电活动没有变化, 而经过4h的Ringer液冲洗后细胞才逐渐出现电生理应答, 这种应答延迟产生的原因可能是由于激活基因组应答需要时间。应答期间细胞电活性适度增强, 细胞放电模式没有显著变化, 但表现出激活静息态 Dahlgren细胞并增加暴发型细胞数量的趋势[47]。

泌乳刺激素 泌乳刺激素能够促使鱼鳃氯化物分泌细胞去分化[46], 并降低渗透调节表面离子和水的通透率,从而使鱼类在低渗环境中能够存活[48]。Marley, et al.对离体CNSS标本进行泌乳刺激素灌流, 实验结果显示 Dahlgren细胞对于泌乳刺激素的应答延时较短, 在药物灌流及4h的Ringer液冲洗期间内细胞放电频率均有所增加, Dahlgren细胞的动作电位发放模式也发生了改变, 部分静息态细胞被激活, 位相型和暴发型细胞数量有所增加[47]。

5-羟色胺 5-羟色胺(5-HT)出现在CNSS的中央神经元部分[49], 免疫组化结果显示 Dahlgren细胞受到下行5-HT神经纤维的支配。Hubbard, et al.发现, 对离体CNSS标本灌流5-HT会引发T1型Dahlgren细胞的静息膜电位产生浓度依赖性的可逆超级化(5-HT浓度越高, 超级化越明显), 细胞膜的输入阻抗和时间常数也会随着细胞膜的超级化而减小。在胞内记录点附近注射5-HT会立即中断自发性的暴发放电; 同样, 在细胞外记录时, 灌流 5-HT会中断所有记录细胞的暴发放电, 停止灌流后15 min暴发放电恢复, 这表明5-HT对于CNSS活性具有抑制作用。灌流更低浓度的 5-HT1受体激动剂 5-carboxamidotryptamine(5-CT)同样会产生上述效果。然而, T2型细胞对于5-HT或5-CT均未产生电生理应答, 说明T1、T2型细胞之间存在着功能上的差别[50]。

乙酰胆碱 Conlon, et al.在鲑鱼CNSS标本中证实了有乙酰胆碱的分泌, 并发现随着细胞膜的去极化, 乙酰胆碱分泌量明显增加[51]。Brierley, et al.发现川鲽T1型Dahlgren细胞的一个亚群会受到乙酰胆碱的刺激而兴奋,乙酰胆碱是迄今为止发现的唯一能使这些神经元细胞产生去极化的神经递质[26]。已有研究表明哺乳动物垂体后叶荷尔蒙神经元会受到乙酰胆碱受体激动剂 Oxotremorine (氧化震颤素)和 Nicotine (尼古丁)的调节[52,53]。oxotremorine会在很大程度上抑制Dahlgren细胞放电, 并增加一种非Dahlgren细胞(α神经元)的电活性。分别对海水和淡水适应性川鲽 CNSS标本进行药物灌流, 发现Nicotine能够诱发SWA Dahlgren细胞产生暴发放电(对正在暴发放电的细胞无影响), 却会抑制FWA Dahlgren细胞的放电[26]。

类肾上腺素 Hubbard, et al.发现对川鲽CNSS标本灌流肾上腺素或去甲肾上腺素会使 Dahlgren细胞静息膜电位产生具有浓度依赖性的可逆大振幅超级化, 并可使Dahlgren细胞的自发性放电立即中止[50]。超级化会抑制去甲肾上腺素能神经元活性, 从而降低激素的分泌速率。输入阻抗和膜时间常数的波动表明有多种细胞机制受到了超级化的影响, 如细胞膜表面选择性离子通道的开放和关闭。灌流另一种内生性儿茶酚胺dopamine(多巴胺)没有效果, 说明儿茶酚胺诱发的超级化只能通过肾上腺素受体调节, 而多巴胺受体没有参与。灌流β肾上腺素受体激动剂 isoprenaline(异丙肾上腺素)也会激发超级化(低于肾上腺素或去甲肾上腺素激发的超级化的最大值), 表明 β肾上腺素受体亚形具有一定的调节效果。灌流具有膜通透性的非水解 cAMP类似物 8-[4-chlorophenylthio]-cAMP则会引发一个小振幅的超极化, 并伴有小幅度膜电阻的增加, 说明 β肾上腺素受体在一定程度上能控制cAMP敏感性离子通道关闭[39]。已有报道表明α1肾上腺素受体激动剂 phenylephrine(苯肾上腺素)能够增加哺乳动物视上核垂体后叶荷尔蒙神经元的放电频率[54], 而 α2肾上腺素受体激动剂 clonidine(氯压定)则对视上核神经分泌细胞起抑制作用[55]。Hubbard, et al.对Dahlgren细胞灌流 phenylephrine发现电生理参数没有变化, 而灌流clonidine则会引发超级化(低于肾上腺素或去甲肾上腺素激发的超级化的最大值)。这些结果表明肾上腺素抑制Dahlgren细胞的活动会受到α2和β肾上腺素受体亚形的调节[39]。

4 总结与展望

电生理技术已渗透到生物学的各个领域, 成为生物学研究的一种重要技术手段。将该技术与分子生物学、免疫学、行为学等领域相结合, 能够从细胞和分子水平揭示生命活动的内在机理及其与环境的相互作用。虽然已对Dahlgren细胞基本的电学特性进行了报道, 但往往局限于电活性较强的T1型细胞, 且主要集中在盐度应激、神经调质刺激等条件下T1细胞放电的变化, 而对于相对活性较低的T2型Dahlgren细胞的电生理特点、兴奋性较低的原因及其在神经内分泌调控中的作用有待进一步研究。随着现代电生理技术的不断发展, 鱼类应对其他应激条件刺激时 Dahlgren细胞的放电变化、更多种类的神经调质对于Dahlgren细胞放电影响以及对于Dahlgren细胞膜上各种离子通道的开关机制、功能特点及离子的跨膜流动等方面的研究必将更加深入。

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THE APPLICATION OF ELECTROPHYSIOLOGICAL TECHNIQUES IN THE STUDY ON THE FISH CAUDAL NEUROSECRETORY SYSTEM

LÜ Wei-Qun, CHENG Ruo-Bing and LAN Zhao-Hui
(Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Education, Shanghai 201306, China)

电生理技术; 尾部神经分泌系统; Dahlgren细胞; 动作电位

Electrophysiological techniques; Caudal neurosecretory system (CNSS); Dahlgren cell; Action potential

S917

A

1000-3207(2014)04-0780-06

10.7541/2014.109

2013-06-18;

2013-12-20

国家自然科学基金(31072228、41376134); 高等学校博士学科点基金(20113104110002); 上海市科学技术委员会项目(11PJ1404500); 上海高校水产学一流学科建设项目资助

吕为群, 教授, 博士生导师; 研究方向为适应生理学, E-mail: wqlv@shou.edu.cn