根际pH对玉米利用磷酸单酯和双酯盐的影响

王 悦, 符 力, 冯 固

(中国农业大学资源与环境学院， 北京 100193)

磷酸酶的活性受土壤pH、 底物浓度等因素的影响[2]。根据磷酸单酯酶最大活性时所在的pH范围将磷酸酶分为酸性磷酸酶和碱性磷酸酶，最适pH值高于7.0的称为碱性磷酸酶，低于7.0称为酸性磷酸酶[5-6]。植物根系和土壤细菌能够分泌酸性磷酸酶[7-8]，pH 值高于 7.0 时酸性磷酸酶活性迅速降低[5]。相对于酸性磷酸酶，碱性磷酸酶由细菌产生，底物专一性强[9]。此外，植物对土壤中有机磷的利用除了受磷酸酶活性影响之外，另一个重要影响因素是磷酸酶底物有效性的大小[10]，而根际pH不仅影响磷酸酶活性，而且还显著影响底物的有效性[11]。以往关于磷酸单酯酶的研究报道已经较多，而根际pH变化对磷酸双酯盐和磷酸单酯盐矿化过程的影响有何区别未见报道。

本文研究目的在于了解作物利用磷酸单酯盐或磷酸双酯盐的过程是否受到根际pH变化的调节。本试验采用琼脂无菌培养体系，通过向玉米植株供应不同氮源(硝态氮、 铵态氮)和磷源(植酸钙、 卵磷脂)，分析了玉米根际磷酸单酯酶和磷酸双酯酶的活性对根际pH的响应及相应磷酸盐的利用，以期为理解玉米根际磷营养的调控提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试植物

供试植物为玉米磷高效基因型181(ZeamaysL.181)。挑选饱满、 大小一致、 重量相差小于0.1 g的玉米种子，在超净台内用70%的乙醇浸泡10 min，然后用15%的H2O2浸泡20 min，用无菌水冲洗3次，最后在无菌水中浸泡2 h。灭菌完成后，将种子放在装有MSR培养基直径为9 cm的培养皿中，每皿四粒种子，盖上培养皿盖，用石蜡膜封口，置于黑暗中在27℃培养箱中萌发。5 d后，挑选根系形态相似，大小一致的无菌玉米幼苗，去胚乳，转移至无菌试验装置中，用石蜡膜封口后放在光照培养箱中培养，光周期为12 h，光照强度为500 μmol/(m2·s)。

1.2 培养基质

1.3 试验设计

试验采用无菌培养装置，以直径150 mm，高14 mm的培养皿为底座，培养皿盖上打孔(与瓶口大小一致)，上方粘结300 mL无色透明的塑料瓶，满足植株地上部生长空间，整个装置密封后经辐照灭菌，灭菌后在超净工作台完成倒培养基、 移苗等步骤。在瓶的顶部打几个小孔，贴上空气过滤膜(图1)。

图1 无菌培养皿试验装置示意图 Fig.1 Diagram of the Petri dish system used in the experiment

培养21 d后收获。收获时，小心地将带有塑料瓶的培养皿盖打开，用干净的镊子或解剖刀沿着玉米根系将覆盖于根表的琼脂剥离开来，注意不能损伤根系，将根完整地取出，根系用灭菌的去离子水冲洗干净，放入装有10 mL无菌去离子水的离心管中，溶液要将根系完全浸没，将整个植株放在正常光照下30 min，收集根分泌物。30 min后，将植株取出，用吸水纸沾干，在相同的部位剪下地上部，称取地上部鲜重，放入信封、 编号，在105℃下杀青30 min，70℃下烘干至恒重，然后称取干重。

1.4 测定项目与方法

1)根际pH的测定: 将根从琼脂中小心取出后，沿根痕迹横向1 cm内取琼脂至5 mL离心管中，将琼脂充分打碎，用精密pH仪(UB-7, Denver Instument, Dever, USA)测定pH值。

2)根际磷酸酶活性测定: 根际磷酸单酯酶活性用改进的Tabatabai 和Brimner[12]的方法测定； 根际磷酸双酯酶活性参考Richardson等[13]的方法测定。

1.5 数据处理

试验数据均采用Excel进行计算，采用SPSS 15.0统计软件进行双因素方差分析(two-way AVOVA)，5%水平最小显著差异法(LSD)进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 供氮形态及有机磷形态对玉米生物量及氮、 磷吸收的影响

供氮形态显著影响玉米的生长。在相同的有机磷酸盐条件下，供应硝态氮处理的玉米地上部干重均显著高于铵态氮处理。根系干重在卵磷脂为磷源条件下也表现为硝态氮处理显著高于铵态氮处理。不同有机磷酸盐对玉米生长也存在显著影响。在供应铵态氮时，卵磷脂与植酸钙处理的地上部和根系生物量均没有显著差别。但是供应硝态氮时，地上部和根系生物量均表现为卵磷脂处理的显著高于植酸钙处理(表1)。

供应植酸钙时，铵态氮处理的玉米植株来自有机磷酸盐的磷量显著高于硝态氮处理。不同有机磷酸盐对植株来自有机磷酸盐的磷量也有显著影响，在供应铵态氮条件下，植酸钙处理的植株来自有机磷酸盐的磷量显著高于卵磷脂处理； 供应硝态氮时，卵磷脂处理显著高于植酸钙处理(表1)。

供氮形态显著影响玉米的地上部氮含量，而对玉米根系的氮含量无显著影响。在相同有机磷酸盐条件下，硝态氮处理的地上部氮含量均显著高于铵态氮处理(图2A)。不同有机磷酸盐对玉米地上部和根系氮含量也有显著影响，在供应铵态氮时，植酸钙处理的地上部氮含量显著高于卵磷脂处理(图2A)，而根系氮含量，无论是供应铵态氮还是硝态氮，卵磷脂处理的均显著高于植酸钙处理(图2B)。

表1 供应不同氮素形态条件下玉米地上部干重、 根干重和来自有机磷酸盐的磷量

图2 供应不同氮素形态条件下玉米地上部氮含量(A)、 根氮含量(B) Fig.2 N content in the shoots (A), N content in the roots (B) of maize in response to different nitrogen forms

2.2 不同供氮形态、 有机磷形态对玉米根际pH和根际磷酸酶活性的影响

由表2可以看出，玉米根际供应不同形态氮素能显著改变根际pH值。相同有机磷处理下不同氮素形态处理间比较，无论以植酸钙还是卵磷脂为有机磷源，玉米根系吸收铵态氮后，根际pH都显著降低，至收获时，达到4.0左右，而硝态氮作为氮源，根际pH值上升至 6.6左右。相同供氮处理条件下，不同有机磷酸盐处理间比较，无论根际供应铵态氮还是硝态氮，植酸钙与卵磷脂处理的根际pH值之间均没有显著差异。

表2 供应不同氮素形态条件下玉米根际pH, 根际磷酸单酯酶活性和磷酸双酯酶活性

供氮形态显著影响玉米根际磷酸单酯酶和磷酸双酯酶的活性(表2)。在相同有机磷酸盐处理条件下，供应硝态氮处理的根际磷酸单酯酶活性均显著高于铵态氮处理。对于根际磷酸双酯酶而言，以卵磷脂为磷源条件下也表现为硝态氮处理显著高于铵态氮处理。不同有机磷酸盐对玉米根际磷酸单酯酶和磷酸双酯酶活性也存在显著影响，无论是供应硝态氮还是铵态氮，以卵磷脂为磷源条件下的根际磷酸单酯酶活性均显著高于植酸钙处理。根际磷酸双酯酶活性也表现为根际供应硝态氮时卵磷脂处理显著高于植酸钙处理。

3 讨论

图3 玉米根分泌的磷酸单酯酶、 磷酸双酯酶活性对pH的响应 Fig.3 The response of phosphomonoseterase and phosphodiesterase activities to pH

不同类型的磷酸酶对有机磷酸盐具有底物专一性，磷酸双酯需要先通过磷酸双酯酶水解磷酸双酯键，其产物在磷酸单酯酶作用下进一步水解成正磷酸根[4]。以往的研究通常只检测磷酸单酯酶活性，并依据缓冲液的pH将这类磷酸酶分为酸性或碱性磷酸酶，这样不考虑底物测定的结果不能完整地解释不同形态有机磷的矿化过程。本研究证实，玉米根系分泌的磷酸单酯酶和磷酸双酯酶最适pH略有不同，并且以卵磷脂为有机磷源时，两种酶活性与玉米吸收相应的有机磷酸盐的量呈显著正相关性(图4)，说明玉米根系分泌的磷酸酶对有机磷的活化利用发挥了直接的作用。

图4 玉米植株来自有机磷酸盐的磷量与根际磷酸单酯酶(A)和磷酸双酯酶(B)活性的关系 Fig.4 The correlation between P from organic phosphates and rhizosphere phosphomonoseterase (A) and phosphodiesterase (B) activitie

有机磷的水解过程由磷酸酶活性和有机磷底物有效性两个因素控制[10]。首先，酶活性与环境pH密切相关。本试验证明供应铵态氮或硝态氮改变了玉米根际pH，导致根际磷酸单酯酶和磷酸双酯酶的活性发生了变化(表2)。供铵态氮时，pH值降低到4.0，酶活性偏离其适宜pH值较远。而供应硝态氮时，根际pH在最适范围附近，磷酸酶活性较高(表2和图3)。然而，在供应铵态氮时，玉米对植酸钙的利用大于硝态氮处理，尽管供铵态氮时磷酸酶活性并不比供硝态氮时更高。

植酸钙是难溶性的有机磷酸盐，它不能直接与磷酸酶结合，即使在根际中存在较高的磷酸单酯酶活性的条件下，玉米对其活化利用效率也不高。供应铵态氮时，pH值降至4.0，这比供应硝态氮时 (pH值达6.6) 更有利于植酸钙的溶解，增加了植酸根对于磷酸单酯酶的有效性，促进更多的植酸态磷的矿化，使玉米获得了比供硝态氮时更多的磷。因而，在供应铵态氮时，植酸钙溶解度较高而两种磷酸酶活性较低，植酸钙处理中玉米吸收的磷量要高于卵磷脂处理。相反，在供应硝态氮的条件下，植酸钙溶解度较低而两种磷酸酶活性较高，与植酸钙处理相比，此时卵磷脂处理的植株吸收了较多的磷(表1)。这一结果说明pH 4.0(供铵态氮)比pH 6.6(供硝态氮)更有利于植酸钙的溶解，使植酸根对磷酸单酯酶底物有效性更高，从而有利于植酸磷的矿化。卵磷脂不与金属离子结合，pH对其底物有效性的影响不大，其矿化量主要受磷酸酶活性的制约，pH对磷酸双酯酶活性的调节直接影响卵磷脂的活化利用。以植酸钙为有机磷源时玉米植株来自磷酸盐的磷量与根际磷酸单酯酶活性的相关性不显著，而以卵磷脂为有机磷源时玉米地上部磷含量与根际磷酸单酯酶活性(R2=0.7526,P=0.0252)或磷酸双酯酶活性(R2=0.9372,P=0.0015)均有显著的线性正相关关系，这也间接说明了底物有效性对于有机磷活化利用的作用大于磷酸酶活性。

综上所述，土壤中大多数有机磷被土壤胶体颗粒吸附或与金属离子结合形成沉淀[17-18]。本研究结果表明，土壤有机磷的活化必须首先转化为能溶解于溶液中的形态，底物与磷酸酶能更好地结合并水解。我国长期施用化肥导致北方土壤大范围酸化[19]，本试验结果说明这种酸化对土壤固有或随有机物料进入农田的有机磷的活化无疑是具有重要贡献的，在北方土壤养分管理中应加以考虑。

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