老年性上睑下垂患者眼轮匝肌组织中Elastin、MMP-9、MMP-12的表达变化及意义

庞润晖，白 萍，苗 杰，王 娟，张宏斌，段国琴

(1邢台市眼科医院，河北省眼病治疗中心，河北省眼科学重点实验室，河北邢台054001; 2邢台市人民医院;3宁晋县中西医结合医院)

老年性上睑下垂是常见的老年性眼睑退行性病变，临床表现为上睑皮肤下垂，遮盖瞳孔、额部皱纹加重、眉毛上移、上睑皮肤牵拉延长等［1，2］。关于老年性上睑下垂的形成机理，考虑可能为皮肤松驰、弹性减退、提上睑肌乏力及Muller氏肌渐趋萎缩乏力综合因素所致［3］。国外研究［4］表明，在上睑折叠区，Muller氏肌键、提上睑肌腱膜、睑板前眼轮匝肌和联合筋膜内有大量的弹性纤维表达，而弹性纤维是由弹性蛋白(Elastin)构成，基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-12能有效降解弹性蛋白和细胞外基质。2011年6月～2013年6月，我们检测了30例老年性上睑下垂眼轮匝肌组织中Elastin、MMP-9、MMP-12，观察其表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择我院收治的老年性上睑下垂患者30例(观察组)，男11例，女19例;年龄50～72岁，平均61岁;提上睑肌肌力0～4 mm 5例，4～8 mm 12例，8～12 mm 13例;另选30例单睑行重睑手术患者作为对照组，男5例，女25例;年龄18～35岁，平均22岁，提上睑肌肌力正常。两组一般资料无统计学差异，具有可比性。

1.2 Elastin、MMP-9、MMP-12的检测方法 将术中切除的睑板前眼轮匝肌组织用10%甲醛溶液固定，经常规组织脱水、透明石蜡浸泡与包埋备用。4μm厚石蜡切片，60℃烘片30 min，二甲苯脱蜡15 min ×3次，梯度乙醇水化。切片于3%H2O2溶液中浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶。后置于乘有枸椽酸盐抗原修复液的电热式压力蒸汽灭菌器中，高压修复20 min，室温下冷却，PBS洗5 min×3次。滴加10%正常山羊血清，湿盒内作用30 min，中和非特异性抗原。再滴加经预试验确定的浓度(1∶200)兔抗人Elastin、MMP-9、MMP-12单克隆抗体(武汉博士德公司)，置湿盒内作用60 min后4℃过夜，PBS缓冲液洗5 min×3次;滴加生物素化羊抗兔lgG二抗(1∶100)作用30 min，PBS缓冲液洗5 min×3次。滴加新鲜配置的DAB显色液，显色5～15 min，流水洗涤。苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。用已知阳性切片作为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。Elastin、MMP-9、MMP-12在眼轮匝肌的染色均为胞质着色，以棕黄色或淡黄色定性为阳性。用MPIAS-1000真彩色病理图像分析系统(北京航空航天大学图像中心)测定1 000个细胞中阳性细胞数，取其平均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。采用t检验。随机统计1 000个肌纤维细胞中免疫组化染色阳性细胞总数，实验数据经Kolmogorov-Smirnov检验证实呈正态分布，均以±s表示，各组样本均数经Levene检验方差齐性。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

观察组Elastin、MMP-9、MMP-12阳性细胞数分别为(210.12±46.76)、(345.12±58.23)、(365.54 ±30.28)个，对照组分别为(460.34±5.21)、(153.32±21.45)、(126.27±16.31)个，两组比较P均＜0.05。

3 讨论

随着我国老龄人口的增加，老年性上睑下垂的发病呈逐渐上升趋势，据统计其发病率约占老年人口的11.5%，患者出现睑裂变形、变窄，向前注视比较困难，常出现仰视征象，给老年人带来许多不便［5］。关于老年性上睑下垂的发病机理，目前观点不一［6，7］。有人认为，由于年龄的增长，部分老年人的提上睑肌肌肉供血不足，肌纤维渐趋萎缩，力量降低，从而出现了上睑下垂;也有人认为，老年性上睑下垂是由于皮肤松驰、弹性减退及Muller肌渐趋萎缩乏力综合因素所致。刘瑞华等［8］观察了20例老年性上睑下垂患者眼睑皮肤，发现皮肤角质层变薄、扁平，基底细胞排列散乱、大小不一，眼睑皮肤胶原纤维数量和质量均下降。

Elastin是一种细胞外基质蛋白，主要由成纤维细胞产生，在体内与微原纤维结合形成弹性纤维。弹性蛋白的下降代表弹性纤维的减少，而体内有多种物质能够分解弹性蛋白，如MMP和丝氨酸蛋白酶。MMP-9、MMP-12均是基质金属蛋白酶家族中的新成员，其能有效降解弹性蛋白和细胞外基质，而且是对抗弹力纤维的最活跃的MMP［9，10］。这三种因子均可在眼睑皮肤及眼轮匝肌组织表达，根据它们之间的不平衡表达可推测出眼睑松弛的发病机理［11］。本研究显示，与对照组比较，观察组Elastin阳性细胞数减少，MMP-9、MMP-12阳性细胞数增加，推测老年性上睑下垂肌肉松弛的发病机理与弹性蛋白含量下降有关，弹性蛋白的下降导致弹性纤维含量的减少，而弹性蛋白降解酶的增加又进一步促进弹性蛋白的降解。这与以往对皮肤松弛的研究结果是一致的，皮肤弹性蛋白的含量随着年龄的增长、紫外线的照射，成纤维细胞逐渐减少，胶原纤维和弹力纤维逐渐排列紊乱、变性、扭曲，引起皱纹、松弛及下垂等皮肤衰老表现［12，13］。从我们的实验研究可以看出，这些改变不仅是皮肤衰老的结果，也将进一步促进眼轮匝肌的松弛，甚至提上睑肌的松弛。

近十余年不断有细胞抗皮肤衰老报道，如注射成纤维细胞或移植表皮干细胞等［14，15］;但因其维持时间短或取材困难等而受限。金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)是MMP的抑制剂，可以抑制其对胶原的降解作用，若能在此环节加以干预调节，抑制MMP的过度表达，或者利用MMP-TIMP之间的动态平衡解决衰老的问题，可在一定程度上抑制或者延缓眼睑皮肤及眼轮匝肌的松弛进程。尽管老年性上睑下垂的手术方法已经成熟，但因各个地方的医生水平良莠不一，相当一部分老年人对手术有恐惧的心理，根据我们的研究结果，如果能研制出对抗弹性蛋白下降或提高MMP水平的药物进行皮肤层及眼轮匝肌层的注射治疗，从基础学方面延缓皮肤及肌肉的老年性改变，相信会给广大的老年患者带来福音。

总之，老年性上睑下垂眼轮匝肌组织Elastin表达下降，MMP-9、MMP-12表达上升，其发病机理可能与上述指标变化有关。

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