RNA干扰治疗技术的应用研究

钱 江，傅仲学

(1重庆市垫江县中医院，重庆408300;2重庆医科大学附属一院)

RNA干扰(RNAi)是20世纪90年代发现的一种在进化过程中具有保守作用的特异性序列，是由dsRNA介导的、存在于动物和植物中的转录后基因沉默现象，最先在矮牵牛属植物中发现［1］。一些体外和体内研究表明，绝大多数疾病是由于部分基因的遗传损伤或过度表达所致，因此这部分基因成为以RNAi技术为基础的临床治疗方法的潜在目标［2］。动物模型研究表明，以RNAi技术为基础的药物可以有效地治疗各种疾病［3］。目前正在开发用于治疗年龄相关性黄斑变性的RNAi疗法，只需直接喷射含有血管内皮生长因子(VEGF)的特异性短干扰RNA(siRNA)进入玻璃体腔内，从而有效地将siRNA注射入眼球中。运用RNAi疗法可直接将siRNA注入肺组织内治疗呼吸道合胞病毒感染而引起的肺炎。然而，以RNAi技术为基础治疗其他疾病，特别是在治疗肿瘤方面的开发和利用以及将siRNA转导至靶组织中的研究和开发工作更有重要意义。

1 RNAi疗法治疗肿瘤

肿瘤是RNAi基础治疗的主要目标之一，肿瘤基因、肿瘤抑制基因的突变和其他促进肿瘤发展的基因都可以成为RNAi基因沉默技术应用的重要潜在目标。由于作用机制确切、高特异性和高效率，RNAi介导的基因沉默可以减少与化疗药物密切相关的不良反应。RNAi主要优势是可以同时针对肿瘤进展中涉及不同细胞途径的多个基因进行治疗，可以将以小分子为基础治疗肿瘤产生多药耐药性的概率降到最低。以RNAi技术为基础疗法的另一个优点是可以开发适用于特定患者的个性化抗癌药物，这种个性化的药物可以更有效地控制肿瘤，从而提高药物治疗肿瘤的成功率。CALAA-01是转铁蛋白靶受体，是用纳米封装的非化学修饰的siRNA特定的核糖核苷酸还原酶 M2亚基(RRM2)，参与DNA的复制。CALAA-01结合转铁蛋白受体和释放含有RRM2特异性的siRNA通过细胞内吞作用后，抑制RRM2基因的表达，从而防止转铁蛋白受体在肿瘤细胞中的增殖。已有医药公司进行了针对实体瘤患者的全身用药的CALAA-01的Ⅰ期临床试验［4］，从黑色素瘤患者治疗后的肿瘤活组织切片检查显示细胞内的局部有纳米粒子的存在，并在基因和蛋白水平降低RRM2的表达。Ⅰ期临床实验表明，CALAA-01的siRNA患者的全身给药，可以沉默肿瘤细胞中的与肿瘤相关的基因［4］。

2 siRNA治疗的药代动力学策略

目前，研究者所面临的主要问题是以siRNA为基础治疗肿瘤和其他疾病时如何提供针对siRNA的体内靶细胞群。以siRNA为基础的抗肿瘤药物的疗效，取决于强而有效的肿瘤细胞基因沉默，实现有效的体内基因敲除需要将siRNA送至靶组织。siRNA分子的高负电荷使其在体内的吸收效率降低;而且核内体的siRNA降解与快速清除是经血液通过肾脏排泄的，因此siRNA通过静脉途径进入体内后，其效力也将大大降低。为了实现有效的siRNA传递与基因沉默治疗，需要一个理想的药物递送系统保护siRNA不受核酸酶的降解，并提高其稳定性，防止非靶组织的非特异性摄取，并提高治疗靶细胞和组织摄取siRNA［5］。对于局部摄取，未修饰的siRNA可以简单的配方(如生理盐水)局部应用在各种组织中包括呼吸道上皮细胞、眼和中枢神经系统引起明显的基因沉默效果［6］。全身用药时，siRNA的传送面临巨大挑战。未加任何药物生理盐水配制的siRNA静脉注射后在血清由核酸酶降解，并经肾脏快速排泄出体外。因此，如果尝试全身siRNA用药，需要提高siRNA血清半衰期，使其能分布到靶组织，在其靶细胞的胞质内释放，才不会降低随后的摄取，并避免脱靶基因沉默活性的降低。

为提高基因沉默活性的效率，siRNA的化学修饰必不可少，因为这些修饰的siRNA可保持其在血清中的稳定性［7～9］。一个理想的修饰应加强siRNA的稳定性，而不会影响其基因沉默活性。siRNA在核糖环的2’位置上的修饰已被证明可以防止核酸内切酶的降解，增加siRNA的稳定性。其他包括在2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟上的修饰，能提高血清的siRNA的稳定性，并提高其在体内的效力。通过受体介导的内吞作用或通过膜透性的增加，带负电荷的siRNA与胆固醇的共轭可以增强的siRNA的摄取［10］。Soutschek 等［11］报道，胆固醇共轭的 siRNA的靶向载脂蛋白B，可以增加siRNA在血清中的稳定性和增强其基因沉默活性。据观察，血清胆固醇载脂蛋白B特异siRNA的共轭与通过静脉内给药的未结合的对照组相比，可以使siRNA肾清除率明显下降，并使血清半衰期增加16倍。更重要的是，胆固醇共轭也促进了受体siRNA介导的肝细胞的摄取，并使小鼠肝脏中60%的载脂蛋白B基因沉默。与胆固醇的共轭siRNA治疗方法更加有助于将siRNA传递到肝脏，从而形成一种有效的治疗肝癌的方法。

siRNA体积小(平均粒径＜10 nm)，未配制的siRNA可以很容易地从人体排泄，从而出现siRNA的生物利用度降低，药代动力学特性较差［12］。有研究通过核酸酶提高siRNA的粒径，并防止其降解，专门设计纳米颗粒较大(50～200 nm)的siRNA以抑制小鼠模型中的肿瘤生长［13］。这些纳米粒子，由共轭生物惰性聚合物直接插入siRNA或者制备封装siRNA的脂质体构成，在血清中较稳定，可提高药代动力学效能，从而改善这些治疗分子的生物利用度。有效地将siRNA传递至靶组织，纳米粒子的大小非常重要。研究显示，纳米粒子大小从10～200 nm的被视为最优;因为通过受体介导的内吞作用，小到足以穿过细胞膜，大到足以被保留在人体内，从而提高siRNA的治疗效果［14］。

3 siRNA靶组织传递特异性及安全性

改善siRNA靶组织传递特异性，应使有治疗作用的siRNA定位在肿瘤细胞，避免定位在正常细胞。目前已经制定了一些促进细胞类型特异性siRNA传递的策略，包括抗体，配体及核酸适配体。抗体对特定的抗原具有极高的亲和力和选择性识别能力。抗体片段有众多的抗原识别域，如识别艾滋病毒包膜糖蛋白的一个高度带正电的鱼精蛋白能成功传递siRNA的靶向HIV序列至病毒感染的CD4+T细胞，从而抑制病毒的复制。此外，静脉注射抗血管生成的siRNA络合Fab-鱼精蛋白的融合蛋白成功定位至皮下植入的肿瘤细胞，可抑制肿瘤生长［15］。此外，细胞类型特异性传递方面也获得了可用适配体，为高度结构化的核酸分子(RNA和DNA)及与其亲和的一个特定目标分子。核酸适配体都是通过几次绑定到达特定的细胞表面的靶抗原［16］，与单个RNA适配子可以直接连接到以siRNA分子为细胞特定类型产生的嵌合RNA中。与前列腺特异性膜抗原(PSMA)特异性结合的适配体将siRNA传递至前列腺癌细胞，抑制前列腺肿瘤在小鼠异种移植模型中的生长已被证明有效［17］。

除了特定目标的siRNA传递，siRNA治疗的另一问题是意外脱靶效应［18］。以siRNA为基础疗法的传递和脱靶效应是联系在一起的，高效递送siRNA至靶癌细胞会降低正常细胞的暴露数量，有利于肿瘤细胞吸收siRNA，从而减少了潜在的脱靶效应。此外，siRNA有效传递到癌细胞也会减少siRNA治疗剂量，从而最大限度地减少与治疗剂量相关的不良反应。siRNA治疗的另一不良反应是导致大量炎症性细胞因子(如干扰素-α、肿瘤坏死因子-α和白介素-6)诱导的先天免疫系统的激活，导致免疫功能紊乱。因此，开发以siRNA为基础的治疗技术需慎重。

目前，临床亟须有效方法阻止实体肿瘤的进展和转移。以siRNA为基础的治疗方法对开发展新型有效的肿瘤治疗药物、减少药物不良反应有重要意义，有效的siRNA分子靶传送至体内癌细胞对治疗效果至关重要［19］。多个siRNA分子通过不同细胞途径特异性靶向治疗各种肿瘤，同时沉默多个致癌基因，可有效抑制恶性肿瘤的增长。

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