浅谈鸭瘟病毒的分离与鉴定方法

刘 昆 （山东省昌乐县畜牧兽医局 262400）

鸭瘟(Duck Plague，DP)，是由鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)引起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性接触性传染病，其特征是流行广泛、传播迅速、发病率和死亡率高，严重威胁养鸭业的发展。

1 鸭瘟病毒分离

DPV主要侵害免疫器官，病毒的分离一般采用发病急性期或者死亡后的病鸭血液、肝、脾或者肾脏等组织处理后接种细胞培养物、雏鸭及鸭胚进行病毒的分离鉴定，后结合电镜观察及血清学诊断加以确诊。

1.1 细胞培养

病毒接种鸭胚成纤维细胞(DEF)后，产毒量高，蚀斑明显，病毒分离效果好；成纤维样传代细胞系CCL-41产毒量较DEF低，但病变稳定、蚀斑易观察，同时传代细胞系健康史可知，更易获取。

1.2 鸭胚分离

通过接种9～14日龄鸭胚绒毛尿囊膜分离病毒，4～10d后鸭胚死亡并出现特征性的弥散性出血，致死的胚体出血、水肿，肝出血、坏死，部分绒毛尿囊膜上有灰白色坏死灶。若初代分离为阴性时，收获鸭胚绒毛尿囊膜均质化处理后盲传2～4代可产生病变。

1.3 雏鸭接种

肌肉注射1日龄易感雏鸭(番鸭较北京鸭更易感)，3～12d后感染鸭发病死亡，尸检典型病变，确诊可结合攻毒保护试验或免疫荧光技术。低毒力或非致病毒株可能不引起临床症状，此时应检测存活鸭体内抗体水平。

2 鸭瘟诊断方法

2.1 血清学诊断

2.1.1 血清中和试验(SN) 血清学试验主要采用固定血清/稀释病毒法，根据中和指数M做出判定：0

2.1.2 微量固相放射免疫试验(Micro-SPRIA) Micro-SPRIA是以表面能吸附抗体的塑料或其它材料作固相载体，用同位素标记抗体或抗原微量，测定相应抗原或抗体的一种微量检测技术。该方法可用于直接检测肝、脾、脑及血清等病料，于人工发病后46h就能以80%的检出率检出雏鸭肝脏中的病毒，成年鸭于48h后可检出，其检出率为100%。此法特异性强、敏感、快速、经济，但实验条件要求较高。

2.1.3 琼脂糖凝胶沉淀试验(AGP) AGP是在琼脂糖凝胶中进行的抗原抗体免疫沉淀反应。特点是简单、特异、试验条件要求低，既可定性又可定量，易于推广，但敏感性不好。

2.1.4 反向间接血凝试验(RPHA) RPHA法利用抗体致敏红细胞在相应抗原存在时会凝集而进行检侧。该法3h可判读结果，操作简便，不需昂贵的设备试剂，致敏细胞可长期保存，但敏感性较明胶颗粒凝集试验及间接免疫荧光试验分别低25倍和65倍，不适合小量DPV检测。对以诊断为目的急性DPV感染来说，感染患鸭大量排毒而使送检组织存在大量病毒，RPHA足够敏感，具有实用价值。

2.1.5 酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA是DPV诊断上使用最广泛的一种方法，简单快速、经济准确。既可测抗体又可检抗原，样品需要量少，结果容易判断，易于基层推广，是一种适合于对鸭群进行免疫抗体水平检测，简便实用的方法

2.1.6 免疫荧光技术 免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术快速准确，敏感性稍低于雏鸭接种，但费用设备要求较高，且非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序比较复杂。

2.2 分子生物学诊断

DPV的分子生物学研究一直相对滞后于其它疱疹病毒，上世纪80年代中期以来分子生物学技术被逐渐应用于DPV诊断并取得了极大进展。

2.2.1 核酸探针技术 核酸探针技术是最早用于DPV诊断的分子生物学方法，使用放射性或非放射性物质标记核酸作为探针，在待检组织细胞识别特定核酸序列并显示阳性杂交信号。地高辛标记探针技术是以非放射性的地高辛标记核酸片段，利用碱基互补原理检测目的核酸片段的一种方法。该方法不需要特殊仪器，结果易于判定，重复性好，是目前广泛应用的分子生物学检测技术

2.2.2 聚合酶链式反应(PCR) 聚合酶链式反应(PCR)具有灵敏性高、特异性强、操作简便、检测时间短等特点。快速准确地检测处于潜伏期的DPV，同时PCR检测体系以感染组织的DNA为模板，不需提纯病毒，检测结果受样品质量的影响较小，为迅速地检测病毒，及时采取 防治措施赢得了宝贵时间。

2.2.3 原位杂交技术 原位杂交(in situ hybridization ISH)技术是分子生物学和组织化学成功结合的产物，能对组织细胞内特定的DNA或RNA序列进行定位研究。该方法具有直观、特异性强的优点，是对DPV进行检测和病原定位的良好方法，可用于DPV的侵染过程和致病机理研究及回顾性诊断检测。同时，还可观察病原定位的细胞类型以及组织细胞的形态结构特征与病理变化。

鸭瘟病毒广泛存在于各种水禽，各年龄段的鸭均可发病。近几年，鸭瘟在我国很多地区流行，给我国的养鸭业造成了巨大的经济损失。了解病毒的分离与鉴定方法，有利于建立有效的诊断方法，对鸭瘟的防控有重大意义。