文蛤抗菌物质的粗提及活性检测

张赛乐王雪鹏闫茂仓柴雪良艾为明谢起浪*

（①浙江省海洋水产养殖研究所 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室 浙江 温州 325005）

②山东农业大学动物科技学院 山东 泰安 ③温州生命科学学院 温州医学院海洋科学研究所）

文蛤抗菌物质的粗提及活性检测

张赛乐①王雪鹏②闫茂仓①柴雪良①艾为明③谢起浪①*

（①浙江省海洋水产养殖研究所 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室 浙江 温州 325005）

②山东农业大学动物科技学院 山东 泰安 ③温州生命科学学院 温州医学院海洋科学研究所）

为了分离纯化得到文蛤体内的抗菌活性蛋白，以灭活的副溶血弧菌诱导的方法，通过紫外分光光度计法测定其粗提品的蛋白质含量，并进行抗菌活性检测，同时利用硫酸铵沉淀法对粗提物进一步纯化、SDS-PAGE电泳检测纯度。结果显示，文蛤经副溶血弧菌诱导后，产生的抗菌物质在短时间内达到高峰，随后逐渐下降，大约在4h时对大肠杆菌抑制率最高；诱导4h时抑制率与对照相比无显著差异(P＞0.05)。在经过硫酸铵沉淀后，SDS-PAGE电泳显示条带较多；进行Sephadex G-50凝胶过滤层析的最佳条件为洗脱流速0.2ml/min、样品浓度3.0mg/ml。

文蛤 抗菌物质 硫酸铵沉淀 活性检测 凝胶层析

海洋是生命的摇篮，其面积约占地球表面积的71%。目前已知的海洋生物有21万种，由于海洋环境的特殊性(高盐、高压、低营养、低温、无光照)，迫使海洋生物产生一些结构独特并有显著生物活性的代谢产物以适应严酷的环境，主要活性表现在抗菌、抗病毒、抗凝血、镇痛、抗炎、抗肿瘤和抗心血管疾病等方面。我国海洋资源丰富，为海洋药物的研究与开发提供了优越的基础[1]。

在我国，文蛤(Meretrix meretrix)是一种天然资源丰富的滩涂贝类，为沿海主要的滩涂养殖贝类，是重要的海水增养殖优良品种，也是主要出口的鲜活水产品之一[2]。其经济价值高、营养丰富、肉质鲜美。文蛤不仅肉质鲜美、营养丰富，而且具有很高的食疗药用价值。李时珍的《本草纲目》上说，它能治"疮、疖肿毒，消积块，解酒毒"等病。近代研究又表明：文蛤有清热利湿、化痰、散结的功效，对肝癌有明显的抑制作用，对哮喘、慢性气管炎、甲状腺肿大、淋巴结核等病也有明显疗效。目前，国内外学者也开展了文蛤中蛋白质和多糖等活性物质提取和分析的研究工作，也证实了文蛤中富含肽类等抗肿瘤活性成分。而近年来关于文蛤抗菌肽的研究未见报道。本文以灭活的副溶血弧菌为诱导物进行诱导，采用大肠杆菌(Escherichia coli)作为指示菌，对文蛤的组织提取物进行抗菌活性测定。可为滩涂贝类抗菌肽基因工程产品(抗菌药物)的开发研究提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料 试验用文蛤(Meretrix meretrix)购于浙江省温州市龙湾区某养殖场，于沙滤海水中暂养7d后进行诱导试验。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，具有强致病性；大肠杆菌(Escherichia coli)为购买的大肠杆菌标准菌株ATCC25922。

1.2 副溶血弧菌诱导物的制备 副溶血弧菌菌株接种于Zobell 2216E斜面，28℃培养24h，用0.65%生理盐水洗下菌苔，加入终浓度为0.3%的甲醛灭活24h后，用TCBS培养基检测灭活效果。确认彻底灭活后，用0.65%生理盐水洗3次，配成终浓度为1×107cfu/ml灭活副溶血弧菌的海水用于诱导。

1.3 诱导 将文蛤浸泡在1×107cfu/ml灭活副溶血弧菌的海水中，定期采集组织。

1.4 取样 于诱导0、4、8、12和24h后(分别为对照组、P1、P2、P3和P4组)取0.50kg的文蛤去壳，将组织剪碎匀浆，匀浆液4℃保存。

1.5 抗菌物质的提取 匀浆液中按体积比1:1加入5%乙酸，4℃搅拌过夜，次日将混合物于4℃、5000r/min离心30min，取上清，4℃保存。将沉淀物用等体积5%乙酸混合，再次4℃搅拌浸提过夜。重复上述离心过程，取上清，合并2次上清液，调节pH为7.0，再离心，弃沉淀，收集上清液，即为粗提品，-20℃保存，部分产物冷冻干燥保存。

1.6 蛋白质含量的测定 采用紫外分光光度法测定蛋白质含量：总蛋白质含量(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260×稀释倍数。

1.7 硫酸铵沉淀 将冻存的诱导4h制备的粗提物样品取出，4℃下融化，滴加等体积饱和硫酸铵溶液使其饱和度达50%，4℃静置过夜后离心得到沉淀物，用原1/2体积PBS缓冲液溶解，并透析除盐。

1.8 抗菌试验 采用微量比浊法[3-5]，菌悬液的制备取细菌菌种接于Zobell 2216E液体培养基，28℃培养16h后，以Zobell 2216E液基调整菌浓度到104cfu/ml，备用。取96孔板，每孔加入10μl抗菌提取物、硫酸铵沉淀产物，然后每孔中加入90μl菌悬液，28℃培养12h。同时设置作生长对照和重复。用酶标仪于450nm处，测定吸光度值。

1.9 Tris-Glycine SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测[6]（1）制胶：参照宝生物工程(大连)有限公司提供的配方，配制浓缩胶、分离胶的浓度分别为5%和12%，缓冲体系为Tris-Glycine体系。（2）制样：将样品溶于样品缓冲液，100℃沸水浴5～10min，5000r/min离心5min，取上清用微量加样器上样。（3）电泳：80V恒压电泳，当溴酚蓝指示带达到分离胶时，加大电压至140V。（4）染色：取出凝胶，放入考马斯亮蓝R-250染色液中，染色1～2h。（5）脱色：倾去染色液，以脱色液覆盖凝胶，缓慢摇动直至获得蓝色条带及干净的背景。

1.10 Sephadex G-50凝胶过滤层析 试验采用Sephadex G-50凝胶柱，用PBS缓冲液进行平衡。取500μl盐析产物上样，在280nm紫外下监测洗脱情况。

2 结果

2.1 总蛋白质含量 乙酸抽提所得的粗提品颜色均为淡黄色、透明溶液，其总蛋白质含量在诱导呈先升高后降低的趋势。

表1 不同诱导时间粗提品的理化性质及蛋白质含量 (mg/ml)

2.2 抗菌活性试验 采用微量比浊法，以大肠杆菌作指示菌，根据吸光度值计算生长抑制率IR(%)，IR(%)=(1-A/A0)×100%，其中A为实验组的吸光度值，A0为生长对照组的吸光度值。

表2 不同诱导时间粗提品的抗菌活性

由表2看出，文蛤经副溶血弧菌诱导后，产生的抗菌物质在短时间内达到高峰，随后逐渐下降，大约在4 h时抑制率最高。

表3 不同诱导时间盐析组分的抗菌活性

由表3得知，文蛤粗提品经硫酸铵沉淀后所得产物均具有抗菌活性，且其抑制率有不同程度的提高，说明盐析产物中抗菌物质含量相较粗提品有所升高，为进一步纯化奠定基础。

图1 不同诱导时间粗提品的SDS-PAGE电泳图谱

图2 不同诱导时间盐析组分的SDS-PAGE电泳图谱

2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 通过SDS-PAGE电泳图谱1、2比较可知，粗提品蛋白条带比较多，经过硫酸铵沉淀后得到的产物条带相对比较清晰，但仍有杂蛋白存在，还需要通过其他方法来进一步提纯，如离子交换、凝胶层析、亲和层析等。

2.4 Sephadex G-50凝胶过滤层析 凝胶过滤层析效果受多种因素影响[7]，采用经4h诱导后制备的盐析组分为上样液比较洗脱流速与样品浓度对Sephadex G-50分离文蛤抗菌蛋白效果的影响。（1）不同洗脱流速对Sephadex G-50分离文蛤抗菌蛋白效果的影响。其它层析条件不变的情况下，本试验选择了4个不同洗脱流速，0.1ml/min、0.2ml/min、1.0ml/min的分离曲线。当流速为1.0ml/min时，由于流速过快，出峰相对较快，一些小峰不能分开；流速为0.1ml/min时，虽能到达最好的分离效果，但由于低流速导致工作效率降低。因此选择0.2ml/min作为最佳洗脱流速。（2）不同样品浓度对Sephadex G-50分离文蛤抗菌蛋白效果的影响。在其他层析条件固定的情况下，选择了1.0mg/ml与3.0mg/ml 2个不同的样品浓度进行分离。样品浓度过低，如1.0mg/ml，使洗脱出来的分离组分吸光度降低，即浓度降低，影响分离的效率，并给以后的样品出来带来不便。因此选择3.0mg/ml作为最佳样品浓度。

3 讨论

在贝类的免疫系统中，除了以通过吞噬作用完成的细胞免疫外，血淋巴中的溶酶体酶、凝集素、非特异性抗菌肽等体液因子也发挥了重要的防御作用[8,9]。近年来，双壳贝类的抗菌物质成为研究的一个热点。郭道森等[10]从毛蚶(Scapharca subcrenata)血浆中分离的抗菌蛋白对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、四连微球菌具有较强的抑菌活性，且该抗菌蛋白具有很好的热稳定性，对胰蛋白酶和蛋白酶K不敏感；Maurice等[11]从贻贝(Mytilus Edulis)血液中分离出一类富含半胱氨酸的防御素Mytilin A，具有抗革兰氏阴性和阳性菌活性，且能杀灭部分真菌；洪旭光[4]从栉孔扇贝(Chlamys farreri)血液纯化出一种全新的抗菌肽(其分子量为2000Da)，不仅有抗真菌活性，还有潜在的抑制肿瘤的作用；Jung-Kil Seo[12]从美国耗(Crassostrea virginica)鳃组织中纯化得到cvH2B.，其氨基酸序列被认定为与组蛋白H2B相似，够抑制包括副溶血弧菌和创伤弧菌在内的革兰氏阴性菌。双壳贝类抗菌物质的研究对利用其以治疗外界微生物入侵引起的疾病有重大的作用。

文蛤生活在滩涂中，且饲养环境也不是无菌，故在养殖期间内不可避免有一定的细菌生长，这可能导致对照与诱导4h时的抗菌物质对大肠杆菌生长的抑制作用无显著差异。至于该抗菌物质是否为饲养环境中的细菌进入文蛤体内后刺激机体免疫系统所产生，还需要进一步研究。粗提品对大肠杆菌有一定的抑制作用，副溶血弧菌诱导后大约在4h达到高峰，随后抑制率逐渐降低；经硫酸铵沉淀后，通过两次SDS-PAGE电泳对比发现，纯度有所提高，也可由两次的抗菌活性试验推断得知。但盐析产物SDS-PAGE电泳显示仍有较多蛋白条带，还需进一步纯化。

本研究选用了Sephadex G-50Fine，其分子量分级范围为：球蛋白1500～30000，初步探讨了洗脱流速和样品浓度对Sephadex G-50分离文蛤抗菌物质效果的影响，洗脱流速过快无法分开一些小峰样品，但流速过慢导致工作效率降低；浓度过低易影响分离的效率，且对后续的样品处理造成不便。另外，凝胶层析分离效果还与葡聚糖凝胶类型、样品的粘度[7]等有关。本研究工作的开展为后续进行文蛤的活性跟踪，确定其抗菌活性成分，发现新的抗菌物质提供了一定的线索。

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S885.3+9

A

1007-1733(2014)07-0003-03

2014–04–09）

温州市科技计划项目(S20100016), 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室开放基金项目(J201205), 浙江省科技计划项目(2012F20029), 中央财政支持地方高校发展专项学科项目(xkc11011), 国家863项目(2012AA10A410-1). 国家贝类产业技术体系浙江综合试验站(CARS-48), 浙江省重大科技专项(2012C12017-3),温州市科技计划项目(2011N0006)

*通讯作者