中药干预对TLR4表达影响的研究进展＊

陈 浩 审校 王 军 武海阔 张英军 天津中医药大学研究生院（天津300193）

Toll样受体（Toll一like receptor，TLRs）是能被某些内源性分子和微生物保守分子成分所激活的一种先天性模式识别受体，也是先天性与获得性免疫系统的联系桥梁，在细胞活化信号的转导中起重要作用。因此，其对机体免疫，特别是感染免疫具有重要意义，它的活化在病原微生物及其内、外毒素诱导炎症发生过程中起着关键作用。TLR4是目前研究发现的TLRs家族中发现最早、研究最深的TLRs。机体多种细胞如单核细胞、浆细胞、中性粒细胞和内皮细胞等细胞表面均能表达TLR4，其配体主要是LPS［1］。作为LPS作用的优先受体，TLR4参与LPS介导的细胞激活及损伤以及引起的感染性免疫反应。目前的研究表明多数中药对LPS介导的TLR4信号通路的抗炎作用是通过影响NF－κB和AP－1转录因子的转录，控制相关炎症因子的释放来实现的，基于此信号转导通路，特将近年来中药干预对TLR4影响的研究概况作一综述，以期为中药治疗相关疾病的临床研究提供思路。

1 LPS介导的TLR4胞内信号转导途径及调节

TLR4是最早发现的TLR亚型之一，该受体作为细菌脂多糖（LPS）受体复合物的跨膜成分而转导LPS信号，为高亲和力或敏感性LPS受体。当TLR4被LPS激活后会引起下游的2条信号通路的激活，即 MyD88依赖性（MyD88－dependent）信号转导途径和 MyD88非依赖性（MyD88－independent）信号转导途径，从而诱导相关炎症基因的表达包括细胞因子和趋化因子，最终导致炎症反应失控［2］。

1.1 MyD88依赖性信号转导

当LPS的信号作用于TLR4时，TLR4的胞浆内段与一个适配体蛋白 MyD88（Myeloid differentiation protein，髓样分化因子88）的同源结构域相结合，MyD88包含2个结构域，与TLR4同源结构域结合的羧基末端和氨基末端死亡结构域（death domain），MyD88的死亡结构域通过与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶IRAK的死亡结构域相互作用，从而使得IRAK自磷酸化，并引起IRAK 与 TRAF6（TNF receptor－association factor－6，TRAF6）形成复合体使得TRAF6同源寡聚化。活化的TRAF6 又 能激 活 TAKl（transforming－growth－factor－β－activated kinase）、TABl（TAK－binding protein 1）和 TAB2（TAK－binding protein 2），促使IKK（IκB kinaseα，βandγ）磷酸化或激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），随即激活下游的几条信号通路，包括NF－κB通路和3条MAPK通路［胞外信号调节激酶（ERK）、c－jun氨基末端激酶（JNK）和p38］最后导致 NF－κB和AP－1（c－fos/c－jun）活化，诱导炎性细胞因子表达［3，4］。即 LPSTLR4－MyD88－NF－κB或 AP－1的激活可以通过2种途径实现，即NF－κB信号途径（IKK途径）和MAPKs途径。

1.2 MyD88非依赖性信号转导

TRIF是MyD88非依赖性信号转导中TIR4的一个重要的接头蛋白［5］，MyD88非依赖性信号转导中的另外一个接头蛋白是LPS诱导的dsRNA依赖蛋白激酶（PKR），已证实与Mal有关。缺失PKR的细胞在对LPS反应时，NF－κB活化表现出严重缺陷。MyD88非依赖性信号转导可引起NF－κB和干扰素调节因子3（IRF3）的迟发激活。而在这一转导过程中TRIF通过其数个N－末端TRAF6结合结构域与TRAF6结合。随后，激活IKK复合体，使IκB泛素化并降解，最终导致NF－κB易位到核内［6］。MyD88非依赖性信号转导还可通过激活IRF3来诱导IFN 8和IFN－response基因的表达从而来引起相关炎症因子的释放。

两途径在活化TRAF6后，其后继传导通路相同［7］：活化的TRAF6激活核因子κB（nuclearfactor－κB ，）诱导激酶，使IκB激酶磷酸化，IκB泛素化而降解，释放进入细胞核，促进各种蛋白质包括各种炎性介质（如IL－1、TNF－α以及组织因子、黏附分子等）基因的转录、翻译，最终导致炎性因子大量释放，并参与组织、器官的损伤。

2 TLR4表达与相关疾病的关系

与TLR4信号通路最密切相关的疾病是脓毒症，由细菌感染引起的脓毒血症进一步发展则可能成为全身炎性反应综合征、多器官功能障碍甚至多器官功能衰竭。此外，TLR4信号通路还与动脉粥样硬化和缺血性再灌注损伤均有一定关系。Oyama等［8］发现，TLR4基因缺乏的大鼠的心肌梗死范围及炎性反应都与对照组相比要小，说明TLR4参与心肌梗死缺血/再灌注损伤的非细菌性炎性反应。由LPS诱导的系统炎性反应会引起内皮细胞增生和TLR4表达增加，虽然对TLR4的表达和LPS刺激的调节机制目前仍不清楚，但LPS和TLR4相互作用导致了血管平滑肌细胞的增生，并且与动脉硬化的发生、发展有一定关系［9］。Pasini等［10］的研究表明，在不稳定型心绞痛的患者中，氧化低密度脂蛋白可以对通过血液中单核细胞的CD14和TLR4的表达的上调而引起细胞因子的过度表达，从而推测氧化低密度脂蛋白可能是通过TLR4信号通路产生炎性反应。

3 中药对TLR4表达的影响

3.1 单体中药

大黄素是大黄中含量较多的蒽醌类化合物，具有抗炎症反应的药理作用。有研究表明.大黄素通过抑制核因子IκBα，IKKα和IKKγ的磷酸化从而抑制NF－κB的转位，使LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的表达减少，并呈时间依赖性，当作用5h时达到最大值。R.Craig等［11］报道大黄素抑制炎症反应机制不仅是抑制通路还能抑制MAPKs信号通路的活化，能抑制LPS诱导的HT－29细胞p38的磷酸化从而影响相关炎症因子的表达，同时高剂量的大黄素还可以抑制JNK的磷酸化。此外，大黄素还能明显地抑制LPS诱导的内皮细胞中NF－κB的活化和IκB的降解来抑制内皮细胞促炎因子IL－1β和IL－6，趋化因子IL－8和 MCP－l的表达［12］。但是对于IL－1β诱导的血管内细胞中的活化和IκB的降解，大黄素却没有产生抑制作用。

研究表明，灵芝抗炎作用的成分主要是三萜类的提取物。它能作用LPS刺激的巨噬细胞，降低p65的磷酸化，从而影响NF－κB的转录活性，不仅如此，它还可以通过减少MAPK的活性，主要是通过下调ERK和JNK的磷酸化而不是p38，进而减少炎症因子如IL－6、TNF－α的产生，达到抗炎的作用［13］。此外，灵芝多糖也可以通过增加IκB激酶、NF－κB和p38MAPK的活性来有效快速的诱导人树突细胞的激活和成熟产生抗炎作用［13］。

黄芩的有效成分以黄芩苷为主。黄芩苷能下调TLR2和TLR4的mRNA和蛋白质的表达，同时降低NF－κBp65，iNOS和COX－2的表达［14，15］。黄芩苷元在治疗败血症等疾病时的作用机制是抑制iNOS蛋白的生成，减少LPS诱导的IκBα的降解、NF－κB－DNA复合体的形成及 NF－κB受体基因的表达［16］。而汉黄芩素可以通过MAPK信号通路阻止NF－κB的活性而抑制MMP－9的基因转录，从而改善动脉粥样硬化和狭窄。S.0.Lee等［17］的研究表明，汉黄芩苷抑制MMP－9的分泌是通过影响ERK、p38MAPK或JNK信号通路来发挥其作用的。

雷公藤内酯是从雷公藤中提取出来的具有生物活性的化合物，具有显著的抗炎及免疫抑制作用。雷公藤内酯通过抑制MyD88和TRIF依赖的信号途径，下调TLR4和TRIF的蛋白表达及活性［18］。雷公藤内酯作用在LPS刺激的巨噬细胞后可以抑制鼠iNOS基因表达，其机制是它能通过抑制MAPK和信号通路，主要是抑制JNK的磷酸化和的DNA结合活性，而不是抑制ERK或p38MAPK途径［19］。

黄芪主要成分是黄酮类和皂苷的化合物。黄芪能减少LPS作用的巨噬细胞的IL－6、iNOS和COX－2的产生，其作用机制是减弱p38和ERK的活性，并且激活增殖蛋白激酶磷酸酶（MKP－1），除此之外，还能抑制 NF－κB的核转位，从而影响下游相关蛋白的表达［20－21］。其单体黄芪皂苷Ⅳ能完全抑制LPS和TNF－α介导的内皮细胞的核转位和－DNA结合的活性，从而发挥抗炎作用［22］。

3.3 中药组方

姜华等［23］研究表明益气活血复方对TLR4/NF－κB信号转导通路及TNF－α、ICAM－1表达有抑制作用，这种抑制作用是浓度依赖性的。益气活血复方通过对TLR4/NF－κB信号转导通路及TNF－α、ICAM－1表达的抑制作用，减少单核细胞与血管内皮细胞黏附，这可能是其防治动脉粥样硬化的机制之一。姜华等［24］研究表明：用益气活血复方干预结果是，TLR4、MyD88、TRAF－6及NF－κB的基因表达明显下降，TLR4、MyD88及TRAF－6蛋白表达明显下降，但是TRAM及TRIF基因表达无明显改变，同时LOX－1、TNF－α及ICAM－1基因表达明显下降，LOX－1蛋白表达明显下降，说明益气活血复方对LOX－1、TNF－α及ICAM－1有明显的抑制作用。通过这种抑制作用可减少单核细胞与血管内皮细胞黏附以及内皮细胞的损伤，从而达到抗动脉粥样硬化的作用。

谢毅等［25，26］研究发现对重症胆管炎大鼠和阻塞性黄疸大鼠进行加味大柴胡汤干预组中TLR4mRNA的表达比造模组和减压组明显减弱。表明TLR4在肝组织的表达量在加味大柴胡汤的作用下有所减少。加味大柴胡汤可能是通过抑制TNF－α等炎症因子，减轻内毒素血症从而下调TLR4的表达，从而切断了部分LPS信号传导通路，减弱了由TLR4中介的炎症反应，因而减轻肝功能的损伤。

李卿姬等［27］实验结果表明，用LPS刺激的人脐静脉内皮细胞后，TLR4表达明显升高，并激活下游MyD88依赖性信号转导通路和非依赖性信号转导通路。通过这两条信号转导通路的激活，最终激活NF－κB。活化后的NF－κB激活下游炎症因子，从而引起动脉粥样硬化等各种炎症性疾病。用补阳还五汤干预24h后，TLR4，MyD88，TRAF－6以及LOX－1的表达明显下降，但是TRAM及TRIF表达无明显改变。

4 结 语

通过以上阐述，我们得出以下结论：以LPS－TLR4信号转导通路为作用靶点，传统中药的抗炎作用机制主要是通过影响NF－κB通路中的pS0、p65、IKK 的磷酸化过程，或抑制IκB 快速磷酸化和泛素化后的降解作用，或抑制NF－κB的核转位，进而抑制炎性因子的产生；此外，还能通过抑制JNK通路、ERK通路和（或）p38通路中相关基因的表达从而影响AP－1转录，最终使炎性因子如TNF－α等的生成减少。中药组方益气活血方和补阳还五汤对TLR4及下游MyD88依赖性信号转导通路有明显的抑制作用，而对MyD88非依赖性信号转导通路无抑制作用。抑制TLR4及LOX－1、TNF－α及ICAM－1的表达的具体途径还不十分明确。另外，大多数目前研究水平都停留在细胞上，体内研究还仍需深入，以后的研究的重点在于进一步探明其作用机制和靶点。

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