CTGF在食管癌组织中表达及其促进凋亡抵抗的作用机制

黄 芳

结缔组织生长因子(CTGF)是CCN家族成员之一[1]。CTGF是一个富含有半胱氨的分泌蛋白，与细胞表面及细胞外基质有关，并且可以与多个整合素相互作用[2-3]。最近的研究表明，CTGF在多种肿瘤的发生和发展过程中也起着重要作用[4-5]。本研究应用pcDNA3.1CTGF过表达载体及siRNA干扰方法，转染人食管癌Eca109细胞，分别增加细胞CTGF的表达及抑制内源的CTGF的表达，并用INF-γ处理，观察其对Eca109细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料

30例食管癌标本取自2009年无锡市第一人民医院胸外科，所有病例均病理检查证实，取癌旁组织为正常对照。培养食管癌细胞系Eca109使用RPMI 1640培养基，其含有10%FBS，在37℃，5% CO2的培养条件下培养。

1.2 CTGF过表达质粒构建及小RNA(siRNA)干扰

通过RT-PCR获得编码CTGF全长的cDNA。PCR产物用含有1%EB的琼脂糖凝胶进行分离，在紫外线下进行切胶纯化。在构建Eca109稳定的细胞株时，应用Lipofectamin的转染试剂将CTGF表达载体和对照载体转染Eca109，并严格按照试剂盒说明书进行操作。最后用600 μg/μl的G418筛选2周，得到克隆后采用Western Blot进行鉴定。

1.3 RNA制备及Real-Time PCR分析

组织标本及细胞的RNA采用前述方法进行制备。用于Real -Time PCR检测的CTGF引物。并以β-actin作为内参，进行PCR扩增反应。本研究所有的反应均为一式三份，并在iCycler iQ system(Bio-Red)上进行反应。所有引物的扩增产物均要进行溶解曲线和DNA凝胶电泳分析。

1.4 免疫组织化学染色

免疫组织化学染色采用Envision两步法进行。食管癌标本和癌旁组织用中性福尔马林液固定，并进行石蜡包埋，包埋后5 μm连续切片，并严格按Envision两步法试剂盒说明书进行操作。

1.5 Western Blot 分析

当细胞长至80%融合时进行细胞收集，并应用PBS清洗2次，之后应用RIPA Buffer于冰上裂解15 min，然后于4℃下离心细胞裂解液15 min，并用Bradford试剂测定存在的蛋白浓度，然后取等量的蛋白样品加入6×SDS-PAGE样品缓冲液，并煮沸5 min，变性后进行10%PAGE电泳，转膜及显色。其一抗是鼠抗CTGF单抗，二抗是由HRP标记的鼠抗IgG。

1.6 统计学分析

应用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理。实验数据均以平均值±标准差的方式表示。采用单因素方差分析的方法进行各组间的比较，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CTGF在食管癌的标本中表达情况

从15例患者的快速冷冻食管癌标本中提取RNA。与癌旁组织相比，CTGF mRNA在73.3%(22/30)食管癌的标本中表达上调。经单变量的统计分析结果显示，两组CTGF mRNA的表达水平存在差异，且差异具有统计学意义(P<0.05)。Western Blot检测在配对的癌旁组织和癌组织中CTGF蛋白表达水平与Real-Time PCR检测的CTGF mRNA表达水平一致。免疫组化染色结果显示，癌旁组织中CTGF表达很弱，在肿瘤细胞胞质中呈强阳性表达。

2.2 过表达CTGF抑制食管癌细胞的凋亡

构建CTGF表达的食管癌Eca109细胞稳定株，并检测了转染稳定株中CTGF蛋白表达水平，并选择了两个不同表达水平的克隆，分别命名为Eca109/CTGF(H)和Eca109/CTGF(M)，对照组细胞命名为Eca109/C。在CTGF过表达的Eca109稳定菌株中，CTGF蛋白水平显著高于对照组细胞水平。

应用IFN-γ(500 U/ml)处理细胞24 h后并检测细胞凋亡情况。流式细胞仪检测结果显示，与对照组的细胞凋亡情况相比，Eca109/CTGF(H)组和Eca109/CTGF(M)组细胞凋亡指数分别下降11.95%和4.22%。在IFN-γ处理后，Eca109/CTGF(H)组和Eca109/CTGF(M)组中Bcl-XL蛋白表达水平明显高于对照组。

2.3 CTGF siRNA转染细胞中CTGF表达水平

在CTGF siRNA转染的Eca109细胞中，CTGF蛋白水平明显低于对照组细胞(CTGF siRNA C)。流式细胞仪检测结果显示，与对照组相比，CTGF siRNA组细胞凋亡指数明显上升(10.16% vs 18.76%)。在IFN-γ处理后，CTGF siRNA组中Bcl-XL蛋白水平低于对照组。

3 讨论

CTGF在创伤修复及纤维化疾病中起重要作用，但是CTGF在肿瘤的发展、演进[6-7]及肿瘤细胞的存活中也有重要作用[8]。本研究中我们发现，与癌旁组织相比，CTGF 在人食管癌的标本中高表达。

细胞凋亡不仅和肿瘤的发生、发展以及退化有着密切的联系，而且是治疗肿瘤的主要目标。本研究发现上调细胞中CTGF后，用INF-γ处理，可明显增加其对INF-γ诱导的凋亡的抵抗性；下调CTGF后，其对INF-γ处理诱导的凋亡抗性明显降低，提示CTGF可能是通过抑制凋亡增加药物抵抗性。

为了探讨CTGF增加细胞凋亡抗性的机制，我们研究了上调CTGF表达及下调CTGF表达，分别用INF-γ处理后，两组细胞与其对照组细胞相比抗凋亡蛋白Bcl-XL蛋白表达情况。上调CTGF后，对于凋亡的抑制伴有Bcl-XL蛋白表达的增加；下调CTGF后，其对INF-γ诱导凋亡的抵抗性减弱同时伴有Bcl-XL的表达下调。CTGF表达增加和减少分别导致特异性的Bcl-XL蛋白表达的增加和降低，提示Bcl-XL在CTGF诱导的凋亡中起重要作用。

本研究结果显示用IFN-γ(500 U/ml)处理细胞24 h后并且检测细胞凋亡情况。流式细胞分析显示，和Eca109/C组相比，Eca109/CTGF(H)组和Eca109/CTGF(M)组细胞凋亡指数明显下降(11.95%vs 4.22%)。为了研究CTGF对于IFN-γ介导的凋亡对抗作用的机制，我们检测了抗凋亡蛋白Bcl-XL的表达水平变化。在IFN-γ处理后，Eca109/CTGF(H)和Eca109/CTGF(M)中，Bcl-XL蛋白表达水平明显高于对照组。

本研究为了研究内源性的CTGF是否在食管癌细胞中凋亡抵抗起作用，我们用RNAi 介导的慢病毒载体下调Eca109中CTGF的基础表达水平。为了检测siRNA转染是否有效的阻断了内源的CTGF的表达，我们检测了CTGF siRNA转染细胞的CTGF的表达水平。在CTGF siRNA转染的Eca109细胞中，CTGF蛋白水平明显低于对照组细胞(CTGF siRNA C)。接下来我们研究干扰CTGF基础表达对细胞凋亡抵抗的影响。用IFN-γ (500 U /ml)处理细胞24 h并且检测细胞凋亡情况。流式细胞分析显示，和CTGF siRNA C组相比，CTGF siRNA组细胞凋亡指数明显上升。

本研究为了进一步检测CTGF siRNA组凋亡指数的上升是否同样与抗凋亡蛋白Bcl-XL相关，我们检测了抗凋亡蛋白Bcl-XL的表达水平变化。在IFN-γ处理后，CTGF siRNA组中，Bcl-XL蛋白水平低于对照组。Bcl-XL对传统的抗肿瘤药物的具有化疗抵抗作用最先见于在表达Erb-B2的乳腺癌细胞中Bcl-XL表达上调，同时对三苯氧胺诱导的凋亡有抵抗性[9]。CTGF诱导Bcl-XL的上调与以前的研究结果一致：在乳腺癌中，CTGF的高表达与不良预后相关，并且增加了乳腺癌细胞的迁移[10]。

以上结果表明，CTGF可以显著增强细胞的凋亡抵抗性，该作用与上调抗凋亡蛋白Bcl-XL有关。由于在标本及细胞中CTGF过表达与其对凋亡的调节作用一致，CTGF可以看做是食管癌化疗敏感性中一个重要决定因素。因此，其可能是食管癌一个新的化疗敏感性预测指标，并且可能是一个新的潜在治疗靶点。

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